具有改进的稳定性的真菌纤维素酶变体制造技术

本发明专利技术涉及真菌内切葡聚糖酶的新变体。本发明专利技术还涉及包含所述变体的酶制剂和洗涤剂组合物，以及用所述变体处理纤维素材料的方法。所述变体具有脱除起球、抗起球和/或抗灰化性能，并提高了在蛋白酶存在下的稳定性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改进的稳定性的真菌纤维素酶变体专利
本专利技术涉及纤维素酶的新变体。本专利技术还涉及包含至少一种纤维素酶的新变体的酶组合物和洗涤剂，以及涉及用所述变体处理纤维素材料的方法。纤维素酶的新变体在纺织品处理和洗涤剂应用中是特别有用的。专利技术背景纤维素分解酶或纤维素酶是具有纤维素分解活性的酶，这意味着它们能够将纤维素底物或其衍生物水解成较小的糖。因此，纤维素分解酶包括纤维素酶和半纤维素酶二者。纤维素酶包括：(1)内切葡聚糖酶(EG,EC3.2.1.4)，其切断内部β-1,4-糖苷键；(2)外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(CBH,EC3.2.1.176,EC3.2.1.91)，其从晶体纤维素聚合物链的还原或非还原端切割纤维二糖；和(3)β-1,4-葡糖苷酶(BG,EC3.2.1.21)，其将纤维二糖和其它短纤维低聚糖(cello-oligosaccharide)水解成葡萄糖。纤维素酶可包含纤维素结合模块(CBM)，其通过称为接头或连接肽的柔性间隔基与催化域分开。纤维素酶基于其性质被用于各个工业领域。在纺织行业，纤维素酶被用于例如牛仔布整理(denimfinishing)，用以在生物石磨(biostoning)过程中产生出牛仔服装的时尚的石洗外观，并且它们也被用于例如在棉制服装表面上清除绒毛并防止起球。在洗涤剂行业中，纤维素酶被用来提亮颜色，防止服装灰化和起球，并改善清洁。纤维素酶被进一步用于食品工业，包括烘焙，及动物饲料制造，并且它们在纸浆和造纸工业中，例如，在脱墨以从纤维表面释出油墨，在改善纸浆排水和纤维改性中，在溶解纸浆中，在减少能耗中，在纸、纸板和纸浆生产的精炼和干燥阶段中具有巨大的潜力。纤维素酶也被用于木质纤维素材料的水解，例如用于生物乙醇的生产。尽管在工业上表现良好的纤维素酶及其变体在例如WO2016/066896和WO2017/106676中有描述，但在不同的工业应用中，对于具有改变的性质(例如改进稳定性和改进性能)的新型纤维素分解酶仍然存在着需求。专利技术概述本专利技术的目的是提供真菌纤维素酶的新的变体，其与对其进行取代的亲本酶相比，显示出在洗涤剂中的改进的稳定性。本专利技术的目的是通过特征在于独立权利要求中所述内容的GH45纤维素酶多肽的变体来实现的。本专利技术的优选实施方案公开于从属权利要求中。本专利技术公开了GH45纤维素酶中的多个氨基酸残基位置，它们对稳定性以及因而对其性能而言是重要的。因此，下文定义的位置组可以被用来通过制备GH45的变体来改进GH45纤维素酶的性质。在实施例中表明这些新的变体与源于嗜热枝顶孢菌(Acremoniumthermophilum)Cel45A纤维素酶的亲本纤维素酶ACM88相比，具有改进的稳定性。由于GH45家族的保守结构和功能，对ACM88变体所获得的结果可以应用来制备其它GH45纤维素酶的变体。特别是，新的变体在颜色恢复(起球去除/脱除起球(depilling))和颜色维护/颜色护理(抗起球)方面具有改进的性能，并且已显示它们在几种洗涤剂组合物中，在蛋白酶的存在下具有优秀的稳定性。特别地，在30℃温度下的长期实验中，在含有蛋白酶的洗涤剂中所述变体显示改进的稳定性。依据本专利技术的第一方面，公开了包括在位置167、210、215、220和225中的取代的GH45纤维素酶多肽的变体，或其活性片段，其中氨基酸位置参考在SEQIDNO:1中列出的氨基酸序列进行编号。依据本专利技术的第二方面，提供一种包含核苷酸序列的分离的核酸分子，所述核苷酸序列编码第一方面的变体。依据本专利技术的第三方面，提供一种包含编码第一方面的变体的核苷酸序列的重组表达载体，所述核苷酸序列与能够在合适的宿主中引导编码所述变体纤维素酶的基因表达的调控序列可操作地连接。依据本专利技术的第四方面，提供一种包含依据第三方面的重组表达载体的宿主细胞。依据本专利技术的第五方面，提供一种产生第一方面的变体的方法，所述方法包括培养第四方面的宿主细胞并任选地回收变体的步骤。依据本专利技术的第六方面，提供一种包含第一方面的变体的酶组合物。依据本专利技术的第七方面，提供一种包含第一方面的变体或第六方面的酶组合物的洗涤剂组合物。依据本专利技术的第八方面，提供一种处理纤维素材料的方法，其中该方法包括使纤维素材料与第一方面的变体或第六方面的酶组合物反应。依据本专利技术的第九方面，提供第一方面的变体或第六方面的酶组合物在洗涤剂、处理纤维、木衍生的纸浆、生物质水解、纺织应用、食品或饲料应用，或在任何涉及含有纤维素材料的改性、降解或去除的应用中的用途。依据本专利技术的另一方面，提供一种用于抗灰化、污渍去除、纤维和颜色护理、生物石磨或生物整理(biofinishing)的方法，其包括将第一方面的变体或第六方面的酶组合物添加到液体中的步骤，所述液体用于处理含有纤维素或纤维素衍生物的织物或服装或其它纺织材料，如织物或服装或纱线。依据另一方面，提供一种GH45纤维素酶多肽的变体，或其活性片段，其包括在位置167、210、215、215、220和225中的至少一个取代，其中氨基酸位置参考在SEQIDNO:1中列出的氨基酸序列编号。在一个实施方案中，所述变体包括从上述位置选出的至少2、3、4或5个取代。如从测试变体的性能和稳定性的实施例中可以看出的，这些位置中的每一个可以用于改进变体的性质，并且当更多的位置被组合取代时，实现甚至更大的改进。附图简述下文将通过优选的实施方案，参照附图更详细地描述本专利技术，其中：图1显示了用于里氏木霉(Trichodermareesei)的转化以表达目的基因(GOI)的表达质粒类型的示意图。重组基因处于里氏木霉(T.reesei)cel7A启动子(Pcel7A)的控制下，并在1型质粒中添加里氏木霉cel7A(Tcel7A)或在2型质粒中添加里氏木霉cel6A(Tcel6A)终止子而确保转录终止。amdS基因(amdS)被包括在内以选择转化子。氨苄青霉素耐药基因(bla)被用于质粒构建。图像使用Biomatters创建的Geneious版本11.0生成。图2A和2B显示在试验监测物(testmonitor)(E-253)的3次洗涤和翻滚循环后，作为暗度增加(4个条纹的-∆L*的总和)的变体与ACM88相比的颜色恢复(起球去除/脱除起球)性能。Launder-Ometer中的洗涤条件为：40℃,60min,16°dH,洗涤剂4.4g/l,pH~8.4,酶剂量2NCU/ml。图2A显示变体D144-D148与ACM88相比的颜色恢复性能。图2B显示变体D149-D152与ACM88相比的颜色恢复(脱除起球)性能。图3显示在室温下(约20-22℃)，在含有蛋白酶(0.7%Savinase16L)的商业液体洗涤剂中储存4天后作为颜色恢复(脱除起球)效果的剩余性能。图3A显示变体DC144-DC148与ACM88相比的剩余性能。图3B显示变体DC149-DC152与ACM88相比的剩余性能。图4显示在室温下(约20-22℃)，在含有蛋白酶(0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种GH45纤维素酶多肽的变体或其活性片段，其包括在位置167、210、215、220和225的取代，其中氨基酸位置参考在SEQ ID NO: 1中列出的氨基酸序列编号。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181113 EP 18205848.71.一种GH45纤维素酶多肽的变体或其活性片段，其包括在位置167、210、215、220和225的取代，其中氨基酸位置参考在SEQIDNO:1中列出的氨基酸序列编号。


2.权利要求1的变体，其中所述变体与具有氨基酸序列SEQIDNO:1的GH45纤维素酶具有至少80%的序列同一性。


3.权利要求1或2的变体，其中所述取代包括Q167、N210、N215、N220和N225的取代。


4.权利要求1-3的变体，其中所述取代包括取代Q167Y、N210S、N215R/S、N220S和N225S。


5.权利要求1-4的变体，其中所述变体与其亲本多肽相比，具有改进的稳定性。


6.权利要求1-5的变体，其中所述变体还包括在位置23、44、65、66、77、193、219、242和244中的一个或多个进一步的取代，优选在位置S23、K44、D65、N66、A77、T193、G219、S242和G244中的一个或多个取代。


7.权利要求6的变体，其中进一步的取代是取代S23P、K44N、D65E、N66Q、A77S、T193V、G219S、S242G和G244T中的一个或多个。


8.权利要求1-7的变体，其包括以下取代：S23P、D65E、N66Q、A77S、Q167Y、N210S、N215R、G219S、N220S、N225S和G244T。


9.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-8的变体的核苷酸序列。


10.一种包含权利要求9的核苷酸序列的重组表达载体，该核苷酸序列与能够在合适的宿主中引导编码所述变体纤维素酶的基因表达的调控序列可操作地连接。


11.一种包含依据权利要求10的重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞优选选自：
真菌细胞，
丝状真菌细胞，其来自子囊菌门(Ascomycota)，盘菌亚门(Pezizomycotina)；优选来自粪壳菌纲(Sordariomycetes)，肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)，肉座菌目(Hypocreales)和小囊菌目(Microascales)和曲霉属(Aspergillus)、金孢属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)和腐质霉属(Humicola)的成员；
更优选来自肉座菌科(Hypocreacea)、丛赤壳科(Nectriaceae)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、小囊菌科(Microascaceae)和木霉属(Trichoderma)(无性型肉座菌(Hypocrea))、镰孢霉属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、丛赤壳属(Nectria)、葡萄状穗霉属(Stachybotrys)、麦角菌属(Claviceps)、绿僵菌属(Metarhizium)、Villosiclava、蛇形虫草属(Ophiocordyceps)、头孢霉属(Cephalosporium)和足放线病菌属(Scedosporium)；
更优选来自里氏木霉(Trichodermareesei)(红褐肉座菌(Hypocreajecorina))、柠檬绿木霉(T.citrinoviridae)、长枝木霉(T.longibrachiatum)、绿木霉(T.virens)、哈茨木霉(T.harzianum)、棘孢木霉(T.asperellum)、深绿木霉(T.atroviridae)、近里氏木霉(T.parareesei)、尖镰孢霉(Fusariumoxysporum)、禾谷镰孢霉(F.gramineanum)、假禾谷镰孢霉(F.pseudograminearum)、镶片镰孢霉(F.venenatum)、藤仓赤霉(Gibberellafujikuroi)、串珠赤霉(G.moniliformis)、玉蜀黍赤霉(G.zeaea)、鞭毛藻丛赤壳菌(血赤壳菌)(Nectria(Haematonectria)haematococca)、纸葡萄穗霉(Stachybotryschartarum)、S.chlorohalonata、麦角菌(Clavicepspurpurea)、蚱蜢绿僵菌(Metarhiziumacridum)、金龟子绿僵菌(M.anisopliae)、稻绿核菌(Villosiclavavirens)、冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)、顶头孢霉(产黄头孢霉)(Acremonium(Cephalosporium)chrysogenum)和尖端足分支霉(Scedosporiumapiospermum)和黑曲霉(Aspergillusniger)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、鲁克文金孢菌(Chrysosporiumlucknowense)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、特异腐质霉(Humico...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·云图宁，L·瓦尔塔卡利，S·马基宁，M·阿拉普拉宁，H·赫尔穆特，M·安德尔斯，M·门尼肯，U·施瓦尼贝格，D·舍瑙尔，P·奥贾帕洛，T·普拉宁，
申请(专利权)人：生化酶股份有限公司，
类型：发明
国别省市：芬兰;FI