用作半胱氨酸蛋白酶的探针的氧化锍叶立德衍生物制造技术

本发明专利技术涉及带有作为弹头的氧化锍叶立德部分的式I的化合物或其盐。此类化合物可以在检测半胱氨酸蛋白酶活性的方法中以及相关诊断或治疗方法中用作半胱氨酸蛋白酶诸如组织蛋白酶X的基于活性的探针。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用作半胱氨酸蛋白酶的探针的氧化锍叶立德衍生物
本专利技术涉及可用作半胱氨酸蛋白酶诸如组织蛋白酶X的基于活性的探针和/或抑制剂的化合物，检测半胱氨酸蛋白酶活性的方法，以及相关的诊断和治疗方法及用途。
技术介绍
根据Lechtenberg等人,ACSChem.Biol.2015,10,945-951,“proteasesarecentralmediatorsofalargevarietyofphysiologicalprocesses”。蛋白水解裂解事件是蛋白质降解、酶活化和蛋白质成熟的基础，并且调节从细胞死亡、迁移和增殖、炎症和免疫应答到血凝固的广泛途径(Rawlings,N.D.和Salvesen,G.(2012)HandbookofProteolyticEnzymes,第三版,AcademicPress,Waltham,MA)。另一方面，异常的蛋白水解常常与严重的障碍有关。此外，蛋白酶通常在细胞中表达，或者作为需要经由如蛋白水解裂解或二聚化的过程活化的无活性酶原分泌。蛋白酶的活化是严格的时间和空间调节的基础，并因此蛋白酶的位置一般不是蛋白酶功能的理想标记。相反，给定蛋白酶的活性形式的空间和时间位置对于理解其功能是必要的。为此目的，已经针对各种蛋白酶开发了基于活性的探针(Deu,E.,Verdoes,M.和Bogyo,M.(2012),Newapproachesfordissectingproteasefunctionstoimproveprobedevelopmentanddrugdiscovery.Nat.Struct.Mol.Biol.19,9-16.)。这些探针被设计成类似于活性位点反应性蛋白酶抑制剂，以特异性标记活性蛋白酶，并因此是研究和诊断的强有力工具。此外，这些探针还为开发出用于潜在治疗应用的选定蛋白酶的有效抑制剂铺平了道路(Deu等人2012,Nat.Struct.Mol.Biol.19,9-16)。感兴趣的目标酶是半胱氨酸蛋白酶，包括半胱氨酸组织蛋白酶，特别是组织蛋白酶X。半胱氨酸组织蛋白酶是溶酶体蛋白酶的家族，其通常在各种人类癌症中上调，并且涉及不同的肿瘤发生过程，诸如血管新生、增殖、细胞凋亡和侵入。半胱氨酸组织蛋白酶家族构成了最大的组织蛋白酶家族，在人类中有11种蛋白酶(称为clanCA，CIa家族)：组织蛋白酶B、C(也称为组织蛋白酶J和二肽基肽酶1)、F、H、K(也称为组织蛋白酶02)、L、O、S、W、V(也称为组织蛋白酶L2)，以及Z(也称为组织蛋白酶X和组织蛋白酶P)。组织蛋白酶作为肿瘤进展的主要参与者出现，使得它们成为广泛的人类癌症的潜在药物靶标。组织蛋白酶X(也称为组织蛋白酶Z/P)是一种半胱氨酸组织蛋白酶，在其家族成员之中较为独特，因为其表现出严格的羧肽酶活性。组织蛋白酶X被认为是许多人类疾病的原因。其表达与若干癌症类型和神经变性疾病相关联，尽管其在正常生理学状态期间的作用尚知之甚少。由于缺乏可特异性测量组织蛋白酶X的蛋白水解活性的可用工具，我们对其功能理解的进展受到了阻碍。组织蛋白酶X有助于巨噬细胞和树突状细胞的粘附和成熟(Obermajer等人,2008)，并且通过裂解谱抑制网格蛋白依赖性吞噬作用(PecarFonovic和Kos,2015)。组织蛋白酶X调节激素信号传导，其中其对缓激肽、血管舒张素或血管紧张素的裂解导致了对它们同源受体的特异性的改变以及不同的下游信号传导(等人,2010)。组织蛋白酶X也由神经元表达，其中其对α-烯醇酶的裂解调节神经突的存活和增生(Obermajer等人,2009)。此外，组织蛋白酶X表达在淀粉样斑块中丰富，其中其可对神经变性病症诸如阿尔茨海默病具有防护作用(Hafner等人,2013；Wendt等人,2007)，并且在神经性疼痛期间在脊髓中丰富(Leichsenring等人,2008)。已经报道了组织蛋白酶XmRNA在多发性硬化症侵袭的脑部的无病理区域中上调(Huynh等人,2014)，并且其涉及IL-1β的生成(Allan等人,2017；或lowski等人,2015)以及介导神经炎症(Allan等人,2017)。其也在乳腺癌(Edgington-Mitchell等人,2015)、胰腺癌(Akkari等人,2014)、前列腺癌(等人,2004)和胃癌(Bernhardt等人,2010；Krueger等人,2005)的微环境中上调，其中其可能促进肿瘤侵袭。因此，组织蛋白酶X有望作为各种不同疾病的临床生物标记和治疗靶标。与大多数组织蛋白酶一样，组织蛋白酶X作为酶原合成，在内溶酶体的酸性环境中被活化。一旦被活化，其还可能受到内源性抑制剂的负调节，尽管可能不是胱抑素C或stefinA(Duivenvoorden等人,2017；等人,1999)。除了其蛋白水解功能之外，组织蛋白酶X还可以通过其原结构域中的Arg-Gly-Asp(RGD)基序来促进整联蛋白介导的信号传导(Akkari等人,2014)。由于这些复杂的翻译后调节模式，调查总蛋白水平的传统生化方法很少能反映蛋白水解活性酶库。因此，需要特异性测量其在自然环境中的活性的能力，以定义其在健康和疾病期间的精确蛋白水解功能。为此，努力主要集中于开发出用于组织蛋白酶X的基于活性的荧光探针(ABP)。荧光ABP是含有亲电子部分(弹头)、赋予选择性的识别序列以及用于检测的荧光团的小分子(Edgington和Bogyo,2013；Edgington等人,2011；Sanman和Bogyo,2014)。当呈活性时，蛋白酶引发对弹头的亲核攻击，从而导致共价不可逆键的形成。然后，通过SDS-PAGE(胶内荧光)、荧光显微镜术、流式细胞计数法或者整个组织或生物体的光学成像，可使用探针标记的评估来定量蛋白酶活性。重要的是，探针结合的共价性质允许通过用特异性抗体免疫沉淀或亲和纯化继之以蛋白质组学分析来进行靶标确认。以前尚未报道过对组织蛋白酶X具有绝对特异性的探针。BMV109，即具有四氟苯氧基甲基酮弹头的荧光淬灭的ABP，是靶向X、B、S和L的泛组织蛋白酶探针(Verdoes等人,2013；Edgington-Mitchell等人,2015)。因为组织蛋白酶X与组织蛋白酶B(即最丰富和遍在表达的组织蛋白酶之一)的尺寸类似，可能难以通过SDS-PAGE明显地分辨这两种蛋白酶。这妨碍了通过胶内荧光进行准确定量。MGP140是基于环氧化物的基于活性的探针，其表现出比BMV109更高的对组织蛋白酶X的特异性，但也与组织蛋白酶B有效地反应(Paulick和Bogyo,2011)。如果在注射MGP140之前用组织蛋白酶B、S和L的抑制剂GB11-NH2对小鼠进行预处理，则可实现组织蛋白酶X的特异性标记。然而，体系的这种操纵导致组织蛋白酶X过度活化，这可能是因组织蛋白酶B活性丧失所致的代偿性反应。因此，至关重要的是开发出对组织蛋白酶X具有改善的特异性的基于活性的探针以允许评估其生理学活性。Shaw公开了肽基锍盐的合成及其对半胱氨酰蛋白酶木瓜蛋白酶和组织蛋白酶B的抑制作用(Shaw,1988)。Go本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种式I的化合物或其盐，/n[化学式.1]/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181220 AU 20189048721.一种式I的化合物或其盐，
[化学式.1]



其中
R1选自(C1-C8)烷基、(C1-C8)羟烷基、(C1-C8)卤代烷基、(C3-C8)环烷基、(C2-C8)烯基和(C2-C8)炔基；
R2选自(C1-C8)烷基、(C1-C8)羟烷基、(C1-C8)卤代烷基、(C3-C8)环烷基、(C2-C8)烯基和(C2-C8)炔基；
R3是α氨基酸的侧链；
R4选自氢和(C1-C4)烷基；
R5选自可检测元件、胺保护基、(C1-C8)烷基、(C1-C8)羟烷基、(C1-C8)卤代烷基、(C3-C8)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C1-C8)烷基羰基、(C1-C8)羟烷基羰基、(C1-C8)卤代烷基羰基、(C3-C8)环烷基羰基、(C1-C8)烷氧基羰基、苄氧羰基和氢；
X是
键；或
经由氨基与R5取代基连接的式II或III的双基部分，
[化学式.2]



其中
R6是α氨基酸的侧链；
R7选自氢和(C1-C4)烷基；
R8是α氨基酸的侧链；
R9选自氢和(C1-C4)烷基；并且
n是1、2、3或4。


2.根据权利要求1所述的化合物，
其中R3是天然α氨基酸的侧链，或所述侧链的结构异构体、同系物和/或结构类似物，
其中所述侧链或其结构异构体、同系物和/或结构类似物任选地被胺保护基或可检测元件取代，并且任选地进一步被一个或多个相同或不同的取代基R3x取代，其中
R3x选自羟基、卤素、(C1-C4)烷基、(C1-C4)羟烷基、(C1-C4)卤代烷基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)卤代烷氧基；或者
其中R3是蛋白原性α氨基酸的侧链，或所述侧链的结构异构体、同系物和/或结构类似物，
其中所述侧链或其结构异构体、同系物和/或结构类似物任选地被胺保护基或可检测元件取代，并且任选地进一步被一个或多个相同或不同的取代基R3x取代，其中
R3x选自羟基、卤素、(C1-C4)烷基、(C1-C4)羟烷基、(C1-C4)卤代烷基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)卤代烷氧基；或者
其中R3是选自甘氨酸、丙氨酸、α-氨基丁酸、缬氨酸、正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、高正亮氨酸、甲硫氨酸、乙硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、左旋多巴、色氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、硒代半胱氨酸、硒代高半胱氨酸、硒代甲硫氨酸、硒代乙硫氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、O-甲基-高丝氨酸、O-乙基-高丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的α氨基酸的侧链，或所述侧链的结构异构体、同系物和/或结构类似物，
其中所述侧链或其结构异构体、同系物和/或结构类似物任选地被胺保护基或可检测元件取代，并且任选地进一步被一个或多个相同或不同的取代基R3x取代，其中
R3x选自羟基、卤素、(C1-C4)烷基、(C1-C4)羟烷基、(C1-C4)卤代烷基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)卤代烷氧基；或者
其中R3是选自甘氨酸、丙氨酸、α-氨基丁酸、缬氨酸、正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、高正亮氨酸、甲硫氨酸、乙硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、左旋多巴、色氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、硒代半胱氨酸、硒代高半胱氨酸、硒代甲硫氨酸、硒代乙硫氨酸、组氨酸、精氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、O-甲基-高丝氨酸、O-乙基-高丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的α氨基酸的侧链，或所述侧链的结构异构体或同系物，
其中所述侧链或其结构异构体或同系物任选地被胺保护基或可检测元件取代，并且任选地进一步被一个或多个相同或不同的取代基R3x取代，其中
R3x选自羟基、卤素、(C1-C4)烷基、(C1-C4)羟烷基、(C1-C4)卤代烷基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)卤代烷氧基；
任选地其中所述α氨基酸选自丙氨酸、α-氨基丁酸、缬氨酸、正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、高正亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。


3.根据权利要求1所述的化合物，
其中R3选自氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)羟烷基、(C1-C8)卤代烷基、(C3-C8)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C6-C10)芳甲基、(C3-C9)杂芳基甲基和-CH2CH2CH2CH2N(R3a)(R3b)；其中
R3a选自可检测元件、胺保护基、氢和(C1-C8)烷基；并且
R3b选自氢和(C1-C4)烷基；任选地
其中R3选自(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C6-C10)芳甲基、(C3-C9)杂芳基甲基和-CH2CH2CH2CH2N(R3a)(R3b)；或者
其中R3选自(C1-C8)烷基、(C6-C10)芳甲基、(C3-C9)杂芳基甲基和-CH2CH2CH2CH2N(R3a)(R3b)；或者
其中R3选自(C1-C8)烷基、苄基、(1H-吲哚-3-基)甲基和-CH2CH2CH2CH2N(R3a)(R3b)；或者
其中R3选自(C1-C6)烷基、苄基、(1H-吲哚-3-基)甲基和-CH2CH2CH2CH2N(R3a)(R3b)；或者
其中R3选自乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、正戊基、苄基、(1H-吲哚-3-基)甲基和-CH2CH2CH2CH2N(R3a)(R3b)。


4.根据权利要求3所述的化合物，
其中如果X是键，则R3a不是胺保护基、氢或(C1-C8)烷基；或者
其中R3a是可检测元件；或者
其中如果X是键，则R3不是-CH2CH2CH2CH2N(R3a)(R3b)。


5.根据权利要求1所述的化合物，
其中R3选自氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)羟烷基、(C1-C8)卤代烷基、(C3-C8)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C6-C10)芳甲基和(C3-C9)杂芳基甲基；任选地，
其中R3选自(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C6-C10)芳甲基和(C3-C9)杂芳基甲基；或者
其中R3选自(C1-C8)烷基、(C6-C10)芳甲基和(C3-C9)杂芳基甲基；或者
其中R3选自(C1-C8)烷基、苄基和(1H-吲哚-3-基)甲基；或者
其中R3选自(C1-C6)烷基、苄基和(1H-吲哚-3-基)甲基；或者
其中R3选自乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、正戊基、苄基和(1H-吲哚-3-基)甲基；或者
其中R3选自正丁基、仲丁基和异丁基；或者
其中R3是正丁基。


6.根据权利要求1所述的化合物，其中R3是-CH2CH2CH2CH2N(R3a)(R3b)；其中
R3a选自可检测元件、胺保护基、氢和(C1-C8)烷基；并且
R3b选自氢和(C1-C4)烷基；
任选地，其中如果X是键，则R3a不是胺保护基、氢或(C1-C8)烷基。


7.根据权利要求3或6所述的化合物，
其中R3a是氢；或者
其中R3a是胺保护基；或者
其中R3a是(C1-C8)烷基；或者
其中R3b是氢。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物，
其中R1是(C1-C8)烷基，任选地其中R1是甲基；和/或
其中R2是(C1-C8)烷基，任选地其中R2是甲基；和/或
其中R4是氢；和/或
其中R5选自可检测元件、胺保护基和氢。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，
其中R6是选自甘氨酸、丙氨酸、α-氨基丁酸、缬氨酸、正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、高正亮氨酸、甲硫氨酸、乙硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、左旋多巴、色氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、硒代半胱氨酸、硒代高半胱氨酸、硒代甲硫氨酸、硒代乙硫氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、O-甲基-高丝氨酸、O-乙基-高丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的α氨基酸的侧链，或所述侧链的结构异构体、同系物和/或结构类似物，
其中所述侧链或其结构异构体、同系物和/或结构类似物任选地被胺保护基或可检测元件取代，并且任选地进一步被一个或多个相同或不同的取代基R6x取代，其中
R6x选自羟基、卤素、(C1-C4)烷基、(C1-C4)羟烷基、(C1-C4)卤代烷基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)卤代烷氧基；
和/或
其中R7是氢；
和/或
其中R8是选自甘氨酸、丙氨酸、α-氨基丁酸、缬氨酸、正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、高正亮氨酸、甲硫氨酸、乙硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、左旋多巴、色氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、硒代半胱氨酸、硒代高半胱氨酸、硒代甲硫氨酸、硒代乙硫氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、O-甲基-高丝氨酸、O-乙基-高丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的α氨基酸的侧链，或所述侧链的结构异构体、同系物和/或结构类似物，
其中所述侧链或其结构异构体、同系物和/或结构类似物任选地被胺保护基或可检测元件取代，并且任选地进一步被一个或多个相同或不同的取代基R8x取代，其中R8x选自羟基、卤素、(C1-C4)烷基、(C1-C4)羟烷基、(C1-C4)卤代烷基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)卤代烷氧基；
和/或
其中R9是氢。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物，
其中所述胺保护基选自苄氧羰基(Cbz)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、烯丙氧羰基(Alloc)、对甲苯磺酰基(Tos)、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(Pmc)、2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、均三甲苯基-2-磺酰基(Mts)、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯基磺酰基(Mtr)、乙酰胺基和邻苯二甲酰亚氨基；
任选地其中所述胺保护基是苄氧羰基。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的化合物，其具有式IA：
[化学式.3]



任选地，其中所述双基部分具有式IIA或IIIA
[化学式.4]





12.根据权利要求1至11中任一项所述的化合物，其中X是键，和/或其中n是1。


13.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，其中所述可检测元件选自荧光标记、生物素标记、放射性标记、螯合剂和生物正交连接手柄。


14.根据权利要求1至13中任一项所述的化合物，其中所述可检测元件是荧光标记；
任选地，其中所述荧光标记选自荧光素、俄勒冈绿、硼杂-二氮杂-引达省染料、罗丹明染料、苯并吡喃鎓染料、香豆素染料、花菁标记或苯并吲哚标记。


15.根据权利要求14所述的化合物，其中所述荧光标记是任选地具有选自以下式的花菁标记：
[化学式.5]






其中在以上各式中，
A选自CH2、C(CH3)2、C(C2H5)2、NH、N(CH3)、N(C2H5)、O、S和Se；
R10选自$-(CH2)p-C(＝O)-&和$-(CH2)q-C(＝O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(＝O)-&；
其中
p是2、3、4、5、6、7或8；
q是2、3、4、5、6、7或8；
r是2、3、4、5、6、7或8；
$表示与花菁部分的氮原子的连接点；并且&表示与分子的其余部分的连接点；
R11选自(C1-C8)烷基和(C6-C10)芳基；并且
R12是H或磺基。


16.根据权利要求14所述的化合物，
其中所述荧光标记是具有选自以下式的花菁标记：
[化学式11]



[化学式12]



[化学式13]



其中在以上各式中，
卷曲的线表示与分子的其余部分的连接点；
并且R11选自(C1-C8)烷基和(C6-C10)芳基；或者
其中所述荧光标记是具有下式的花菁标记：
[化学式14]



其中卷曲的线表示与分子的其余部分的连接点；并且R11是甲基或乙基。


17.根据权利要求1至16中任一项所述的化合物，
其中所述化合物包含至少一个可检测元件；或者
其中所述化合物包含一个、两个或三个可检测元件；或者
其中所述化合物包含一个可检测元件。


18.根据权利要求1至17中任一项所述的化合物，其中R5是可检测元件。


19...

【专利技术属性】
技术研发人员：L埃德金顿米歇尔，S蒙特福德，BM安德森，M萨博，L奥雷利奥，P汤普森，
申请(专利权)人：武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP