包含克隆干细胞的用于治疗移植物抗宿主疾病的药学组合物制造技术

本发明专利技术涉及包含通过干细胞的层分离培养获取的单克隆干细胞的用于预防、治疗或改善移植物抗宿主疾病的组合物及利用其的移植物抗宿主疾病治疗方法。根据本发明专利技术的干细胞的层分离培养及增殖方法，可通过单克隆干细胞的快速增殖，在短时间内大量获取所需的单克隆干细胞，由此获取的单克隆干细胞为移植物抗宿主疾病治疗效果增加的干细胞，可有用地用作移植物抗宿主疾病治疗剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含克隆干细胞的用于治疗移植物抗宿主疾病的药学组合物
本专利技术涉及包含通过干细胞的得以改善的层分离培养获取的单克隆间充质干细胞(MSC，MesenchymalStemCells)的用于预防、治疗或改善移植物抗宿主疾病的组合物及利用其的移植物抗宿主疾病的治疗方法。
技术介绍
移植物抗宿主疾病(GraftVersusHostDisease)为在宿主的免疫功能降低的情况下，通过同种之间的骨髓移植或外周血造血干细胞移植、免疫力降低等的原因而进行的输血等的治疗动作向宿主内流入的其他人的免疫细胞T淋巴细胞不被宿主的免疫体系攻击，在宿主的体内增殖来使得淋巴细胞将患者的细胞识别为非自体(non-self)并攻击宿主的病，根据症状的程度，在严重的情况下，可导致死亡的疾病。移植物抗宿主疾病的原因大致分为2种，为宿主的免疫力弱化和家庭输血。移植物抗宿主疾病分为急性和慢性，若在手术后的100日之前发生，则分为急性，若在手术后的100日之后发生，则分为慢性。移植物抗宿主疾病大部分为急性，包含在移植物的T细胞对于在宿主细胞中存在的特异抗原反应并引起各种症状，作为所发生的症状有感染、巨细胞病毒引起的肺炎、肝炎、肠胃炎。作为皮肤病变，发生与麻疹类似的皮疹，主要在耳廓、手掌、脚掌发生，因此，与其他皮肤疾病具有差异。与皮肤疾病一同伴随肝疾病而发生黄疸且肝数值增加。在肠胃具有问题的情况下，具有恶心、呕吐、食欲不振、腹痛及腹泻症状。目前为止，没有移植物抗宿主疾病的根本性治疗方法，仅可进行缓解症状的治疗，将类固醇治疗用作有效的治疗。近来，尝试在各种疾病的治疗利用干细胞。干细胞具有可生长为我们身体的210多个所有器官的组织的潜在能力，并且可无限分裂，并通过适当的操作而分化成所需的器官。由于这种干细胞的特性，干细胞作为新型治疗剂而备受瞩目，并且利用干细胞治疗难治性疾病的可能性非常高，预计可治疗许多疾病，如白血病、骨质疏松症、肝炎、帕金森病、老年性痴呆、烧伤等。然而，在干细胞的情况下，在很难大量获取其的一点上仍然具有很多限制。作为获取干细胞的方法，可以说从冷冻胚芽细胞获取的方法为有效，但在伦理方面还存在许多争议。为了解决这种问题，还研究了利用体细胞核移植方法或成体干细胞来获取干细胞的方法。比胚芽干细胞研究更加活跃进行的领域为成体干细胞的研究。作为存在于中枢神经系统或骨髓等各种器官中而参与生长期的器官发育及损伤时的再生的细胞，成体干细胞存在于各种器官中，因此可在包括骨髓、脾脏、脂肪细胞等的各种部位获取，但从骨髓获取的方法为最常见的。但是，在从许多各种骨髓细胞中分离并培养多个间充质干细胞的方面上，难以获取始终呈均匀形态的细胞，因此正在进行用于完善这种问题的研究。本专利技术人专利技术了新式的命名为层分离培养法的干细胞的分离方法，通过韩国专利申请KR10-2006-0075676号申请了专利，并取得了授权。与其他方法相比，上述层分离培养法不仅能够以低成本进行，并且不存在污染问题，可不用顾虑混入其他干细胞而有效地获取克隆间充质干细胞(cMSC)的这一点上，与其他干细胞获取方法相比，具有极好的优秀性。但是，尽管上述方法具有优秀性，但为了大量生产间充质干细胞来用作最终产物，层分离培养法需要制备工作细胞库，并通过它来获取最终产物的工序才可取得充分量的间充质干细胞，并且需要约10次传代(Passage)以上的传代培养，因此从这一方面上，难以快速取得单克隆间充质干细胞集团。因此，将干细胞用于研发治疗剂是，还具有各种技术限制，尤其，尚没有用于有效治疗移植物抗宿主疾病的干细胞制备法及利用其的移植物抗宿主疾病的治疗方法。
技术实现思路
技术问题在通过如上所述的层分离培养法的改善来研究用于诱导干细胞的快速增殖的研究当中，本专利技术人发现利用将培养细胞密度调低，并添加抗氧化剂来进行培养的得以改善的层分离培养法的情况下，可仅通过少的传代培养诱导出有效的细胞增殖率的增加，确认了由此获取的单克隆间充质干细胞与通过现有的层分离培养方法获取的克隆间充质干细胞或现有的干细胞相比增加移植物抗宿主疾病的治疗效果，并且完成了本专利技术。因此，本专利技术的目的在于，提供包含通过改善现有的层分离培养法的干细胞的层分离培养及增殖方法获取的单克隆干细胞的用于预防、治疗及改善移植物抗宿主疾病的组合物及其制备方法。技术方案为了实现上述目的，本专利技术提供用于预防或治疗移植物抗宿主疾病的药学组合物，其包含通过下述步骤获取的单克隆干细胞：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm2(cells/cm2)至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。并且，本专利技术提供用于预防或治疗移植物抗宿主疾病的药学组合物的制备方法，其包括通过下述步骤获取单克隆干细胞的步骤：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及步骤5)，通过以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养的步骤，来获取单克隆干细胞。并且，本专利技术提供用于预防、改善或治疗移植物抗宿主疾病的干细胞，其通过下述步骤获取：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。专利技术的效果根据本专利技术的得以改善的干细胞的层分离培养及增殖方法，可通过单克隆间充质干细胞的快速增殖，在短时间内大量获取所需的单克隆间充质干细胞，由此获取的单克隆间充质干细胞为移植物抗宿主疾病治疗效果得以增加的干细胞，可有用地用作移植物抗宿主疾病治疗剂。附图说明图1为示出从人骨髓分离单克隆间充质干细胞的层分离培养法的图。图2为示出通过显微镜观察并确认根据细胞培养密度及细胞培养传代的单克隆间充质干细胞的形态学变化的结果的图。图3为示出通过流式细胞荧光分选技术(FACS，Flowcytometry)分析来将根据细胞培养密度及细胞培养传代的单克隆间充质干细胞的细胞大小及粒度(granularity)的变化以前向散射(FSC，forwardscatter)(A部分)及侧向散射(SSC，sidescatter)(B本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于预防或治疗移植物抗宿主疾病的药学组合物，其特征在于，包含通过下述步骤获取的单克隆干细胞：/n步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；/n步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；/n步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；/n步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及/n步骤5)，以50细胞/cm

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181217 KR 10-2018-01630101.一种用于预防或治疗移植物抗宿主疾病的药学组合物，其特征在于，包含通过下述步骤获取的单克隆干细胞：
步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；
步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；
步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；
步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及
步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。


2.根据权利要求1所述的用于预防或治疗移植物抗宿主疾病的药学组合物，其特征在于，上述步骤5)的培养通过以1000细胞/cm2的细胞密度接种于培养基中来进行。


3.根据权利要求1所述的用于预防或治疗移植物抗宿主疾病的药学组合物，其特征在于，上述步骤5)的培养通过传代2次至传代13次来培养。


4.根据权利要求1所述的用于预防或治疗移植物抗宿主疾病的药学组合物，其特征在于，上述步骤5)的培养基为添加有抗氧化剂的培养基。


5.根据权利要求1所述的用于预防或治疗移植物抗宿主疾病的药学组合物，其特征在于，上述移植物抗宿主疾病为急性移植物抗宿主疾病或慢性移植物抗宿主疾病。


6.根据权利要求1所述的用于预防或治疗移植物抗宿主疾病的药学组合物，其特征在于，上述单克隆干细胞为选自由吲哚胺2，3-双加氧酶、T-细胞可诱导共刺激分子配体、肿瘤坏死因子诱导基因6蛋白、趋化因子(C-X-C基序)配体9、趋化因子(C-X-C基序)配体10及血红素氧合酶-1组成的组中的一种以上的免疫相关标记的表达量得以增加。


7.一种用于预防或治疗移植物抗宿主疾病的药学组合物的制备方法，其特征在于，包括通过下述步骤获取单克隆干细胞的步骤：
步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；
步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；
步骤3)，培养在上述新的...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋淳旭，金时那，文丁炫，
申请(专利权)人：SCM生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR