一种基于滚环扩增产物自组装DNA水凝胶的适配体传感器及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于滚环扩增产物自组装DNA水凝胶的适配体传感器，所述适配体传感器包括OTA适配体、目标物、SH‑PEG功能化纳米金、引物、核酸外切酶Ⅰ、锁式探针、T4DNA连接酶和Phi29DNA聚合酶。本发明专利技术通过增加滚环扩增反应锁式探针DNA序列中的T碱基数量，将纳米金直接组装到DNA水凝胶中，而无需对纳米金进行DNA序列修饰，为实现赭曲霉毒素A的现场及快速检测提供诸多便利。

【技术实现步骤摘要】
一种基于滚环扩增产物自组装DNA水凝胶的适配体传感器及其应用
本专利技术涉及食品安全检测
，尤其是涉及一种基于滚环扩增产物自组装DNA水凝胶的适配体传感器及其应用。
技术介绍
赭曲霉毒素A(OTA)是食品和农产品中最常见的危害物质之一，常存在于酒类、坚果、咖啡、谷类食品中。OTA是一种由曲霉和青霉所产生的次级代谢产物，具有肾毒性、免疫毒性、致畸性和致癌性。食品中OTA的常见检测方法有可视化生物传感器检测方法、荧光生物传感器检测方法、电化学生物传感器检测方法、高效液相色谱法(HPLC)、表面增强拉曼散射检测(SERS)等。其中，可视化检测以其最易实现肉眼检测而被认为是最有前途的现场快速检测方法之一。DNA水凝胶是一种新兴的以DNA为主的三维宏观生物材料，DNA水凝胶以其宏观可视化的特性而使其在可视化检测领域具有极大的优势。目前已有基于DNA水凝胶的可视化检测的报道，这些检测方法多通过将DNA水凝胶的化学或物理变化转化为光信号进而实现可视化检测。首先将目标物适配体序列与其他序列一并组装得到DNA水凝胶，在目标物存在时，目标物会与DNA水凝胶中的适配体序列结合而导致凝胶结构塌陷。然而，这种根据目标物引起的DNA水凝胶结构变化而设计的生物传感器的信号变化来自于DNA水凝胶降解过程中释放的信号分子中。因此，在这种检测模式下，少量目标分子只能引起DNA水凝胶的微小变化，释放的信号分子变化也十分微小，从而导致较高的检测限，无法满足赭曲霉毒素A的现场快速检测。滚环扩增技术是一种等温信号放大技术，可在恒定温度下，通过设计特定引物序列和环状模板序列，在特定DNA聚合酶的作用下，对模板DNA进行等温扩增，可得到由重复序列组成的长链DNA产物。而这种长链DNA产物可在一定条件性进行DNA自组装，进而可形成滚环扩增产物自组装的DNA水凝胶。可将适配体技术于滚环扩增信号放大技术相结合，通过设计滚环扩增反应模板序列，利用适配体、引物和目标物之间的竞争性结合作用，可实现在目标物存在时，才会启动滚环扩增反应，进而得到DNA水凝胶。在这种检测模式下，少量目标物存在时，即可引发滚环扩增反应，进而得到滚环扩增产物自组装DNA水凝胶，可实现对目标分子的高灵敏度检测。但目前，基于滚环扩增产物DNA水凝胶的可视化检测中，需要对纳米金进行DNA修饰，通过修饰在纳米金表面的DNA与DNA水凝胶中DNA之间的碱基互补配对使纳米金与DNA水凝胶相结合。上述纳米金的DNA修饰和纳米金表面DNA与水凝胶种DNA之间的结合为DNA水凝胶可视化检测带来诸多不便。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术申请人提供了一种基于滚环扩增产物自组装DNA水凝胶的适配体传感器及其应用。本专利技术通过增加滚环扩增反应锁式探针DNA序列中的T碱基数量，将纳米金直接组装到DNA水凝胶中，而无需对纳米金进行DNA序列修饰，为实现赭曲霉毒素A的现场及快速检测提供诸多便利。本专利技术的技术方案如下：一种基于滚环扩增产物自组装DNA水凝胶的适配体传感器，所述适配体传感器包括OTA适配体、目标物、SH-PEG功能化纳米金、引物、核酸外切酶Ⅰ、锁式探针、T4DNA连接酶和Phi29DNA聚合酶；所述OTA适配体序列如SEQNo.1所示；所述引物序列如SEQNo.2所示；所述锁式探针序列如SEQNo.3所示。所述SH-PEG功能化纳米金的制备方法为：(1)将0.5mL1％的HAuCl4·4H2O水溶液加入50mL纯水中，在搅拌下加热至沸腾；(2)向其中加入0.4mL5％的柠檬酸钠水溶液，保持沸腾30min，将制备得到的酒红色溶液冷却至室温，避光保存于4℃备用；(3)取5mL步骤(2)制备得到的酒红色溶液，向其中加入0.25mL浓度为5×10-5M的SH-PEG，在37℃下孵育12h，然后以10000rpm离心10min，弃去上清液，制得沉淀即为SH-PEG功能化纳米金，将沉淀分散在30μL纯水中备用。步骤(1)中，1％HAuCl4·4H2O水溶液的配制方法为：将1gHAuCl4·4H2O溶解并定容于100mL纯水中。一种所述适配体传感器的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)制备SH-PEG功能化纳米金；(2)制备DNA水凝胶；(3)将制备的SH-PEG功能化纳米金加入到DNA水凝胶中得到AuNPs/DNA水凝胶；在90℃孵育30min，然后冷却至室温；(4)将AuNPs/DNA水凝胶在2000rpm条件下离心10min，用UV-1800紫外分光光度计测定其在530nm处的吸光度。所述DNA水凝胶的制备方法为：(1)将20μL10-5MOTA适配体和20μL10-5M引物混合并在95℃下退火10min，后采用梯度降温法进行杂交以获得适配体-引物杂交复合物；(2)向其中加入5μL核酸外切酶Ⅰ以酶解未结合的DNA单链，制备得到纯化后的适配体-引物杂交复合物；(3)取10.5μL步骤(2)所得纯化后的适配体-引物杂交复合物，加入待测OTA浓度的目标物，再向其中加入10.5μL10-5M锁式探针及1.0μLT4DNA连接酶混合均匀并在37℃下孵育45min；T4DNA连接酶的酶活为5.0U/mL；(4)随后向其中加入6.4μL10mMdNTPs、2.0μL10u/mLPhi29DNA聚合酶，混合均匀后于37℃孵育2.5h，此后置于4℃孵育12h，对所得产物用纯水洗涤2次后得到DNA水凝胶。步骤(1)中，梯度降温法进行杂交的条件为95℃反应10min，然后自然降温至25℃；步骤(2)中，酶解的条件为37℃反应30min后，于80℃反应15min。步骤(3)中，SH-PEG功能化纳米金与DNA水凝胶的用量比例为：5mLSH-PEG功能化纳米金加入30μLDNA水凝胶体系中。一种基于滚环扩增产物自组装DNA水凝胶的适配体传感器的应用，所述适配体传感器用于检测赭曲霉毒素A。使用所述适配体传感器检测赭曲霉毒素A的方法为：(1)将20μL10-5MOTA适配体和20μL10-5M引物混合并在95℃下退火10min，后采用梯度降温法进行杂交以获得适配体-引物杂交复合物；(2)向其中加入5μL核酸外切酶Ⅰ以酶解未结合的DNA单链，制备得到纯化后的适配体-引物杂交复合物；(3)取10.5μL步骤(2)所得纯化后的适配体-引物杂交复合物，加入待测OTA浓度的目标物，再向其中加入10.5μL10-5M锁式探针及1.0μLT4DNA连接酶混合均匀并在37℃下孵育45min；T4DNA连接酶的酶活为5.0U/mL；(4)随后向其中加入6.4μL10mMdNTPs、2.0μL10u/mLPhi29DNA聚合酶，混合均匀后于37℃孵育2.5h，此后置于4℃孵育12h，对所得产物用纯水洗涤2次后得到DNA水凝胶；(5)将制备的SH-PEG功能化纳米金加入到DNA水凝胶中得到AuNPs/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于滚环扩增产物自组装DNA水凝胶的适配体传感器，其特征在于，所述适配体传感器包括OTA适配体、目标物、SH-PEG功能化纳米金、引物、核酸外切酶Ⅰ、锁式探针、T4DNA连接酶和Phi29 DNA聚合酶；/n所述OTA适配体序列如SEQ No.1所示；/n所述引物序列如SEQ No.2所示；/n所述锁式探针序列如SEQ No.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于滚环扩增产物自组装DNA水凝胶的适配体传感器，其特征在于，所述适配体传感器包括OTA适配体、目标物、SH-PEG功能化纳米金、引物、核酸外切酶Ⅰ、锁式探针、T4DNA连接酶和Phi29DNA聚合酶；
所述OTA适配体序列如SEQNo.1所示；
所述引物序列如SEQNo.2所示；
所述锁式探针序列如SEQNo.3所示。


2.根据权利要求1所述的适配体传感器，其特征在于，所述SH-PEG功能化纳米金的制备方法为：
(1)将0.5mL1％的HAuCl4·4H2O水溶液加入50mL纯水中，在搅拌下加热至沸腾；
(2)向其中加入0.4mL5％的柠檬酸钠水溶液，保持沸腾30min，将制备得到的酒红色溶液冷却至室温，避光保存于4℃备用；
(3)取5mL步骤(2)制备得到的酒红色溶液，向其中加入0.25mL浓度为5×10-5M的SH-PEG，在37℃下孵育12h，然后以10000rpm离心10min，弃去上清液，制得沉淀即为SH-PEG功能化纳米金，将沉淀分散在30μL纯水中备用。


3.根据权利要求2所述的适配体传感器，其特征在于，步骤(1)中，1％HAuCl4·4H2O水溶液的配制方法为：将1gHAuCl4·4H2O溶解并定容于100mL纯水中。


4.一种权利要求1-3任一项所述适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)制备SH-PEG功能化纳米金；
(2)制备DNA水凝胶；
(3)将制备的SH-PEG功能化纳米金加入到DNA水凝胶中得到AuNPs/DNA水凝胶；在90℃孵育30min，然后冷却至室温；
(4)将AuNPs/DNA水凝胶在2000rpm条件下离心10min，用UV-1800紫外分光光度计测定其在530nm处的吸光度。


5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述DNA水凝胶的制备方法为：
(1)将20μL10-5MOTA适配体和20μL10-5M引物混合并在95℃下退火10min，后采用梯度降温法进行杂交以获得适配体-引物杂交复合物；
(2)向其中加入5μL核酸外切酶Ⅰ以酶解未结合的DNA单链，制备得到纯化后的适配体-引物杂交复合物；
(3)取10.5μL步骤(2)所得纯化后的适配体-引物杂交复合物，加入待测OTA浓度的目标物，再向其中加入10.5μL10-5M锁式探针及1.0μLT4DNA连接酶混合均匀并在37℃下孵育45min；T4DNA连接酶的酶活为5.0U/mL；
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【专利技术属性】
技术研发人员：徐斐，郝丽玲，刘馨娜，彭开敏，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31