一种测定蔬菜中硒形态含量的方法技术

本发明专利技术公开一种测定蔬菜中硒形态含量的方法，所述方法使用离子对反相高效液相色谱‑紫外‑氢化物发生‑原子荧光光谱法测试待测样品中的硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒脲、硒代蛋氨酸、硒代乙硫氨酸、亚硒酸根和硒酸根7种硒形态和含量。本发明专利技术的测定方法无机硒提取加入碘乙酰胺，解决了HPLC‑HG‑AFS中分析测试亚硒酸根回收率差的问题；前处理操作快速、简便，蛋白酶所需种类少且用量少，试剂成本低，样品提取率高，大大提高了硒形态HPLC‑HG‑AFS分析方法的灵敏度和分离度；一次可同时分析测定7种硒形态含量，且仪器分析测试时间短。

【技术实现步骤摘要】
一种测定蔬菜中硒形态含量的方法
本专利技术属于质量检测
，具体涉及一种测定蔬菜中硒形态含量的方法。
技术介绍
硒作为一种人体必需的营养元素，人体内各种活性酶的重要组成成分，被世界卫生组织和中华医学会定为二十一世纪继碘、锌后必补的第三大微量营养保健元素。硒在预防克山病、增强免疫力、抗氧化、防癌抗癌、护肝、保心、促进脑力发育、防治糖尿病、调节内分泌与维生素吸收与利用、保护甲状腺和前列腺等方面均发挥着重要作用。硒在生物体内的生物利用度、有效性、毒性以及代谢等不仅与硒的总量有关，更与硒赋存形态密切相关。农产品中硒的常见形态主要分为无机硒和有机硒。无机硒，如硒酸盐、亚硒酸盐，毒性较大，在人体中吸收和利用率低，长期摄入易导致人体病变。有机硒，如硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸等，经生物转换而得，生物活性强，易被人体所吸收和利用，安全无副作用和营养价值高。可以说，硒的赋存形态真正决定了硒在生物体内的可利用价值和营养价值。硒在不同食物中的结合形式和形态种类均不同，有的以蛋白结合态为主，有的与多糖类结合为主，这样就导致不同样品的硒提取释放方法不一。此外，不同种类的样品需要的酶种类不同，不同酶的提取量、提取温度等条件亦不同，因此很难形成针对所有样品统一的硒形态前处理方法。食品中硒形态分析方法有高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)法、高效液相色谱-串联三重四级杆质谱(HPLC-MS-MS)法、体积排阻色谱(SEC-HPLC)法、气相色谱-电感耦合等离子体质谱(GC-ICP-MS)法、毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱(CE-HPLC-ICP-MS)法、高效液相色谱-原子荧光光谱(HPLC-HG-AFS)法等。液相色谱硒形态分离多为离子交换(AE)法和离子对(IP)法，离子对试剂多为三氟乙酸、七氟丁酸和己烷磺酸等，罕见以四丁基溴化铵为离子对试剂分离硒形态的报道。目前，关于食品中硒形态HPLC-AFS分析方法的报道不多，样品类型主要集中于富硒酵母、大米、食用菌和水产品等，且主要方法HPLC-ICP-MS法，但是HPLC-ICP-MS法测硒时存在质谱干扰严重，需要较为丰富的分析测试经验，且其运行成本和购置成本显著较高。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于现有技术中对蔬菜中硒的形态和含量检测灵敏度差，分析时间过长的缺陷，从而提供了一种测定蔬菜中硒形态含量的方法，具体为离子对反相高效液相色谱-紫外-氢化物发生-原子荧光光谱法(IP-RP-HPLC-UV-HG-AFS)。为此，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供一种测定蔬菜中硒形态含量的方法，所述方法使用离子对反相高效液相色谱-紫外-氢化物发生-原子荧光光谱法测试待测样品中的硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒脲(SeUr)、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代乙硫氨酸(SeEt)、亚硒酸根(Se(IV))和硒酸根(Se(VI))7种硒形态和含量，根据硒形态保留时间确定形态，峰面积确定含量。进一步地，包括如下步骤：S1：取1份待测样品加入碘乙酰胺溶液，使用超声波提取后过滤上机测试，测定亚硒酸根的形态和含量；S2：取另外1份待测样品，加入水后超声破壁，再加入蛋白酶使用超声波提取后过滤上机测试，测定除亚硒酸根以外硒的形态和含量。进一步地，步骤S1和S2中所述上机测试的仪器分析测试条件为：液相色谱条件：C18反相色谱柱(250×4.6mm,5μm)，流动相为30mmol/L磷酸氢二铵溶液，其中含有0.5mmmol/L四丁基溴化铵，同时含有2％甲醇，pH为6.0，流速为1.2mL/min，进样量为100μL，柱温为35℃；紫外条件：在线紫外消解(紫外灯功率40w，长度28cm)；氢化物发生条件：0.35％(m/v)氢氧化钾+0.05％(m/v)碘化钾，0.35％(m/v)氢氧化钾+1.5％(m/v)硼氢化钾，10％(v/v)盐酸，泵转速60r/min；原子荧光光谱条件：负高压300V，灯总电流80mA，载气流量300mL/min，屏蔽气流量500mL/min，原子化器高度9mm。步骤S1和步骤S2中，所述过滤包括将经超声波提取后的溶液使用滤纸过滤定容，滤液再经超滤离心管离心净化，最后过膜取溶液液体。优选地，所述定容体积为10-25mL；所述膜为尼龙滤膜，孔径为0.45μm。步骤S2中所述蛋白酶为蛋白酶K，其与所述1份待测样品质量比为1：30-1：40；所述超声破壁的功率为60-90w，时间为60-90s。步骤S1中碘乙酰胺的浓度为1-5mmol/L。进一步地，步骤S1和S2中所述超声提取的功率为20kHz，温度为50-60℃，时间为30min，重复2次。所述待测样品为表面用纯水冲洗干净/擦干、经过匀浆机匀浆1-2min后的蔬菜，所述待测样品每一份的质量为0.5-5g。本专利技术技术方案，具有如下优点：(1)本专利技术采用离子对反相高效液相色谱-紫外-氢化物发生-原子荧光光谱法(IP-RP-HPLC-UV-HG-AFS)来测量蔬菜中的硒的形态和含量，首先利用离子对反相高效液相色谱分离7种硒形态，然后采用紫外灯在线消解将有机硒转化为六价硒，接着采用还原剂将六价硒还原剂为四价硒，最后通过原子荧光光谱法测定硒形态含量。(2)本专利技术的测定方法中对无机硒提取加入碘乙酰胺，解决了HPLC-HG-AFS中分析测试亚硒酸根回收率差的问题；前处理操作快速、简便，蛋白酶所需种类少且用量少，试剂成本低，样品提取率高，大大提高了硒形态HPLC-HG-AFS分析方法的灵敏度和分离度；一次可同时分析测定7种硒形态含量，且仪器分析测试时间短。(3)本专利技术使用四丁基溴化铵做离子对试剂时，可以改善硒形态分离度。若未加入四丁基溴化铵，采用C18色谱柱分离硒形态时时，亚硒酸和硒代蛋氨酸两峰会有重叠，无法完全分离。本专利技术使用添加了四丁基溴化铵的流动相，同时加入甲醇，并限定流动相中各物质的浓度，可以提高硒形态的分离度和灵敏度。(4)本申请使用普通C18色谱柱，其价格远低于阴离子色谱柱，而且采用C18色谱柱的反相液相色谱法对硒代蛋氨酸的灵敏度和分析时间均优于采用阴离子色谱柱的离子交换液相色谱法，前者硒代蛋氨酸的灵敏度可高于后者3～5倍。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例1中20μg/L的7种硒形态标准溶液色谱图；图2为实施例2中富硒蕹菜空心菜色谱图。具体实施方式提供下述实施例是为了更好地进一步理解本专利技术，并不局限于所述最佳实施方式，不对本专利技术的内容和保护范围构成限制，任何人在本专利技术的启示下或是将本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定蔬菜中硒形态含量的方法，其特征在于，所述方法使用离子对反相高效液相色谱-紫外-氢化物发生-原子荧光光谱法测试待测样品中的硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒脲、硒代蛋氨酸、硒代乙硫氨酸、亚硒酸根和硒酸根7种硒形态和含量。/n

【技术特征摘要】
1.一种测定蔬菜中硒形态含量的方法，其特征在于，所述方法使用离子对反相高效液相色谱-紫外-氢化物发生-原子荧光光谱法测试待测样品中的硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒脲、硒代蛋氨酸、硒代乙硫氨酸、亚硒酸根和硒酸根7种硒形态和含量。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：取1份待测样品加入碘乙酰胺溶液，使用超声波提取后过滤上机测试，测定亚硒酸根的形态和含量；
S2：取另外1份待测样品，加入水后超声破壁，再加入蛋白酶使用超声波提取后过滤上机测试，测定除亚硒酸根以外硒的形态和含量。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1和S2中所述上机测试的仪器分析测试条件为：
液相色谱条件：C18反相色谱柱(250×4.6mm，5μm)，流动相为30mmol/L磷酸氢二铵溶液，其中含有0.5mmol/L四丁基溴化铵，同时含有2％甲醇，pH为6.0，流速为1.2mL/min，进样量为100μL，柱温为35℃；
紫外条件：紫外灯功率40w，长度28cm，在线紫外消解；
氢化物发生条件：0.35％氢氧化钾+0.05％碘化钾，0.35％氢氧化钾+1.5％硼氢化钾，10％盐酸，泵转速60r/min；
原子荧光光谱条件：负高压300V，灯总...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏益华，张金艳，戴廷灿，邱素艳，涂田华，
申请(专利权)人：江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所，
类型：发明
国别省市：江西;36