一种苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记及其应用，所述苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记为a1、a2或a3，所述a1为序列1所示的DNA分子；所述a2是苹果基因组中MdLBD3转录起始位点上游339bp处11pb的Deletion多态；所述a3是来源于苹果的与序列1的同源性大于95％、98％或99％的DNA分子；所述苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记的应用包括：鉴定苹果砧木的矮化性状；预测苹果砧木的矮化性状；选育具有不同矮化性状的苹果砧木。本发明专利技术通过开发与矮化性状相关的分子标记，应用，分子标记辅助育种，有利于定向选择育种，缩短育种年限，提高筛选效率。

【技术实现步骤摘要】
一种苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记及其应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记及其应用。
技术介绍
目前，苹果是我国第一大水果，2019年我国苹果经济产量近4300万t，占世界总产量的一半以上，其营养丰富、产量高、耐储藏，是满足人们生活消费水平的促进农业与农村经济发展的支柱性产业。当前，随着我国城市化进程的加快和农村人口结构的老龄化加剧，水果产业逐渐暴露出劳动力不足的生产现状。所以机械作业、省力栽培成为果业发展的必由之路，而矮化栽培具有密植作业、整齐一致、标准化管理等优点，是推广机械化、省力化的前提；并且矮化栽培早果、丰产、优质，是世界乃至我国水果产业发展的趋势。适宜的矮化砧木是推广现代化果园的基础，而砧木矮化机理复杂，其鉴定与筛选周期较长，制约了砧木进程的发展。因此，研究苹果砧木矮化基因变异，对探索砧木矮化机制、提早辅助筛选鉴定、加速育种进程，促进丰产优质栽培意义重大。苹果因其遗传背景复杂、童期长、自交不亲和等特点严重制约了苹果砧木遗传改良及种质创新。通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有苹果砧木矮化机理复杂，其鉴定与筛选周期较长，制约了砧木进程的发展。解决以上问题及缺陷的难度为：苹果(MalusdomesticaMill)风味好、营养丰富，是我国及世界范围内栽培较广、产量较多的树种之一。其栽植模式由传统的乔化希植向矮化密植转变，矮化密植具有经济利用土地、早果丰产、品质优良、适于机械、轻简省力等优点，是我国苹果产业发展的必由之路。矮化砧木是实现矮化密植栽培的基础，砧木矮化性的遗传改良是当前的产业发展的需求。而苹果属植物共17对(34条)染色体，基因组测序表明其包含约4万个基因，其遗传结构高度杂合，聚合了众多农艺性状的杂交优势。砧矮化性状的选择与鉴定是国内外的研究热点和难点，通常情况下科研人员需要培育数万株杂交实生苗，经历多年的选择与鉴定，才能筛选出1～2株有希望优良砧木新品系。例如：英国的M系砧木育种年限为25～38年，加拿大的O系砧木育种年限为23～28年，美国的CG系砧木也经历了25～30年的筛选；我国自育苹果砧木GM系砧木用时24～27年，SH系砧木育种年限近30年，辽砧系砧木的选育也历经20～30年，而苹果砧木矮化性调控机理复杂，需借助砧穗组合试验完成鉴定，是制约苹果砧木选育及水果矮化栽培的技术瓶颈。解决以上问题及缺陷的意义为：传统的田间调查、组织解剖、生理生化等矮化性鉴定方法，筛选周期长、可靠性差、准确度低；如果能在基因水平上鉴定苹果砧木的矮化性，设计开发出矮化基因的分子标记，不但能丰富果树矮化机理的研究，而且能缩短育种周期，提高育种效率，促进水果产业的现代化发展。该专利技术在大量前期工作的基础上，通过遗传分析、基因定位、组学分析等前瞻性研究方法，在主效基因MdLBD3启动子区域发现一个连续11bp(5′-TCAACAACATA-3′)的Deletion特征序列，且该序列与矮化性状完全连锁。以该序列为靶点，开发设计了矮化基因的分子标记，能精准、有效的对实生苗及资源的矮化性状进行提早鉴定及预测；仅需要提取1年生幼苗的1个叶片，通过对PCR扩增产物的电泳检测，即可鉴定出该株系的矮化性状；将常规方法需要8～10年的矮化性鉴定时间，缩短至1～2年时间，相当于缩短了7～8年的鉴定周期，不仅极大的提高了筛选效率，可靠性与稳定性好，还节约了苗期的管理成本和土地的利用效率。在砧木育种学科上，丰富了技术手段，在砧木育种实践上，优化了选择工具，缩短了育种周期；为优良砧木的培育提供了理论指导与技术创新，对促进我国苹果矮化栽培发展和水果产业结构升级意义重大。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记及其应用。本专利技术是这样实现的，一种苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记，所述苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记为a1、a2或a3；a1苹果砧木基因组中“侧向生长组织发育基因MdLBD3”转录起始位点上游存在的11bp的Deletion多态，所述Deletion多态与砧木矮化性紧密连锁；所述a1的特征DNA分子序列为5′-TCAACAACATA-3′。a2根据所述11bp的Deletion多态，设计一对引物：(上游引物)MdLBD3-d-F：5′-GTCGTTGGCCTCTATTCTTCTGCAG-3′；(下游引物)MdLBD3-d-R：5′-TCAAACAGACACCAAGTAGTTCCGT-3′；所述a2是苹果基因组中“侧向生长组织发育基因MdLBD3”自起始密码子向前(5’端)开始计的第326-349位核苷酸。以苹果砧木实生苗或种质资源的DNA为模板，20μLPCR扩增的反应体系，PCR扩增的反应程序为：94℃5min；94℃30s、59℃30s、72℃50s，36个循环；72℃7min，4℃保存；等反应程序下PCR产生经1.5％琼脂糖电泳检测后，如在550bp处存在条带，则表明该材料为矮化型砧木；如果不存在PCR产物，或在550bp处无条带，则表明该材料为乔化型砧木。a311bp的插入多态及开发设计的引物序列的同源性大于95％、98％或99％的DNA分子。进一步，所述PCR扩增的反应体系组成如下(20μL)：2×PCRMix10μL，MdLBD3-d-F溶液1.0μL，MdLBD3-d-R溶液1.0μL，模板溶液2.0μL，ddH2O6.0μL。MdLBD3-d-F溶液中，MdLBD3-d-F的浓度为10μM；MdLBD3-d-R溶液中，MdLBD3-d-R的浓度为10μM。模板溶液中，DNA浓度为500ng/μL。本专利技术的了另一目的在于提供一种所述苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记的应用，所述苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记的应用包括：鉴定苹果砧木的矮化性状；预测苹果砧木的矮化性状；以及选育具有不同矮化性状的苹果砧木。进一步，所述预测苹果砧木的矮化性状的方法，包括：检测待测苹果砧木基于所述分子标记的基因型，LdLi基因型苹果砧木的矮化性>LiLi基因型苹果砧木的矮化性；如果待测苹果砧木的两条染色体中有两条存在所述Deletion分子标记，则待测苹果砧木的基因型为LdLd基因型；如果待测苹果的一条染色体存在所述Deletion分子标记，则待测苹果的基因型为LdLi基因型；如果待测苹果的两条染色体均不存在所述Deletion分子标记，则待测苹果的基因型为LiLi基因型。进一步，所述选育具有不同矮化性状的苹果砧木的方法，包括：检测待测苹果砧木基于所述分子标记的基因型，LdLi基因型苹果砧木的矮化性>LiLi基因型苹果砧木的矮化性；如果待测苹果的两条染色体均缺失所述分子标记，待测苹果的基因型为LdLd基因型；如果待测苹果的一条染色体均具有所述分子标记，待测苹果的基因型为LdLi基因型。所述矮化性为苹果砧木的矮化性，即对嫁接于砧木上的接穗的生长势具有致其矮化的能力，表现为植株的矮化、主干直本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记，其特征在于，所述苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记为a1、a2或a3；/na1苹果砧木基因组中“侧向生长组织发育基因MdLBD3”转录起始位点上游存在的11bp的Deletion多态，所述Deletion多态与砧木矮化性紧密连锁；所述a1的特征DNA分子序列为5′-TCAACAACATA-3′；/na2根据所述11bp的Deletion多态，设计一对引物：/nMdLBD3-d-F：5′-GTCGTTGGCCTCTATTCTTCTGCAG-3′；/nMdLBD3-d-R：5′-TCAAACAGACACCAAGTAGTTCCGT-3′；/n所述a2是苹果基因组中“侧向生长组织发育基因MdLBD3”自起始密码子向前5’端开始计的第326-349位核苷酸；/n以苹果砧木实生苗或种质资源的DNA为模板，20μLPCR扩增的反应体系，PCR扩增的反应程序为：94℃5min；94℃30s、59℃30s、72℃50s，36个循环；72℃7min，4℃保存；等反应程序下PCR产生经1.5％琼脂糖电泳检测后，如在550bp处存在条带，则表明该材料为矮化型砧木；如果不存在PCR产物，或在550bp处无条带，则表明该材料为乔化型砧木；/na311bp的插入多态及开发设计的引物序列的同源性大于95％、98％或99％的DNA分子。/n...

【技术特征摘要】
1.一种苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记，其特征在于，所述苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记为a1、a2或a3；
a1苹果砧木基因组中“侧向生长组织发育基因MdLBD3”转录起始位点上游存在的11bp的Deletion多态，所述Deletion多态与砧木矮化性紧密连锁；所述a1的特征DNA分子序列为5′-TCAACAACATA-3′；
a2根据所述11bp的Deletion多态，设计一对引物：
MdLBD3-d-F：5′-GTCGTTGGCCTCTATTCTTCTGCAG-3′；
MdLBD3-d-R：5′-TCAAACAGACACCAAGTAGTTCCGT-3′；
所述a2是苹果基因组中“侧向生长组织发育基因MdLBD3”自起始密码子向前5’端开始计的第326-349位核苷酸；
以苹果砧木实生苗或种质资源的DNA为模板，20μLPCR扩增的反应体系，PCR扩增的反应程序为：94℃5min；94℃30s、59℃30s、72℃50s，36个循环；72℃7min，4℃保存；等反应程序下PCR产生经1.5％琼脂糖电泳检测后，如在550bp处存在条带，则表明该材料为矮化型砧木；如果不存在PCR产物，或在550bp处无条带，则表明该材料为乔化型砧木；
a311bp的插入多态及开发设计的引物序列的同源性大于95％、98％或99％的DNA分子。


2.如权利要求1所述的苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系组成如下：2×PCRMix10μL，MdLBD3-d-F溶液1.0μL，MdLBD3-d-R溶液1.0μL，模板溶液2.0μL，ddH2O6.0μL；MdLBD3-d-F溶液中，MdLBD3-d-F的浓度为10μM；MdLBD3-d-R溶液中，MdLBD3-d-R的浓度为10μM；模板溶液中，DNA浓度为500ng/μL。


3.一种如权利要求1～2任意一项所述的苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记的苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记的应用，其特征在于，所述苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记的应用包括：鉴定苹果砧木的矮化性状；预测苹果砧木的矮化性状；以及选育具有不同矮化性状的苹果砧木。


4.如权利要求3所述的苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记的应用，其特征在于，所述预测苹果砧木的矮化性状的方法，包括：检测待测苹果砧木基于所述分子标记的基因型，LdLi基因型苹果砧木的矮化性>LiLi基因型苹果砧木的矮化性；
如果待测苹果砧木的两条染色体中有两条存在所述Deletion分子标记，则待测苹果砧木的基因型为LdLd基因型；如果待测苹果的一条染色体存在所述Deletion分子标记，则待测苹果的基因型为LdLi基因型；如果待测苹果的两条染色体均不存在所述Deletion分子标记，则待测苹果的基因型为LiLi基因型。


5.如权利要求3所述的苹果砧木矮化性辅助筛选分子标记的应用，其特征在于，所述选育具有不同矮化性状的苹果砧木的方法，包括：检测待测苹果砧木基于所述分子标记的基...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨锋，韩振海，刘志，张新忠，何明莉，邱昌朋，王颖达，李威，黄金凤，
申请(专利权)人：辽宁省果树科学研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21