本发明专利技术提供一种PD1/PDL1单抗致免疫性心肌炎模型的制备方法，包括通过AAV9介导模型心肌组织高表达PDL1，再对心肌组织高表达PDL1的模型应用PD‑1/PD‑L1单抗造模。本发明专利技术还提供了该制备方法所制备的动物模型的用途。本发明专利技术制备的模型真实模拟应用PD‑1/PD‑L1单抗发生免疫性心肌炎的患者的发病机制和临床经过，模型更接近于临床患者病理生理状态，成模率高并可动态监测。
【技术实现步骤摘要】
PD1/PDL1单抗致免疫性心肌炎模型及制备方法
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及PD1/PDL1单抗致免疫性心肌炎模型及制备方法。
技术介绍
PD-1/PD-L1单抗是肿瘤免疫治疗史上的里程碑，为新近备受瞩目的免疫检查点抑制剂之一，是肺癌、黑色素瘤等许多恶性肿瘤的一、二线治疗药物，明显延长了患者总生存期和中位无进展生存期，且适应证仍在增加，但是其副作用也逐渐受到关注，其中心肌炎是最为致命的，因其干扰了心脏正常的电机械功能，且心肌再生能力差，发生免疫性损伤后通常修复不良，因此需要高度警惕肿瘤免疫治疗导致的免疫性心肌炎，规定如应用PD-1/PD-L1单抗后发生心肌炎，需要永久性停药，并立即给予大剂量激素及免疫抑制剂治疗，然而预后仍旧很差，一旦发生，死亡率为40％，当与CTLA-4单抗如伊匹木单抗联用时，死亡率可高达67％。据文献报道PD-1/PD-L1单抗单药应用免疫性心肌炎发病率约万分之六，与CTLA-4单抗联用则增至千分之三，但是随着PD-1/PD-L1单抗应用增多，关于免疫性心肌炎的报道逐渐增加，由于我国恶性肿瘤患者基数大，近年来应用PD-1/PD-L1单抗的患者比例迅速增加，因此发生心肌炎的患者数量多，其高致死性已成为我国肿瘤慢病管理的难题。由于自然状态下患者应用PD-1/PD-L1单抗发生自身免疫性心肌炎概率低，要想研究其机制、早期预警标志物及新的治疗方式有赖于动物模型的成功建立。我们前期的动物试验结果也说明直接给予PD-1/PD-L1单抗造模成功率非常之低。Keynote024、042等多项研究显示肿瘤组织TPS(PDL1表达率)越高，应用PD-1/PD-L1单抗抗肿瘤效果越好。文献中提及心肌组织表达PDL1，是应用PD-1/PD-L1单抗导致免疫性心肌炎的原因之一；采用PDL1Ig基因重组腺病毒为载体，将PDL1Ig基因转入BN大鼠树突状细胞同时输注受体，以Lewis大鼠为受体，行同种肾移植，转染组为实验组，发现PDL1基因修饰的DC(树突状细胞)可显著延长移植肾存活时间。说明如果能够使物种心肌组织高表达PDL1，那么应用PD-1/PD-L1单抗发生免疫性心肌炎的概率也大大提高。腺相关病毒是微小病毒科家族的成员之一。这一家族成员是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4.7～6kb之间的线状单链DNA基因组。它的复制和增殖依赖于辅助病毒的存在。作为一种基因导入系统，AAV病毒(腺相关病毒)载体具有安全性好，免疫原性低，能感染分裂细胞和非分裂细胞，能介导基因的长期稳定表达等优点。其中，AAV9是公认的高效特异性靶向心脏表达的病毒载体血清型。AAV9不仅会感染心肌细胞，也会感染心脏其他细胞,本团队拟用心肌细胞特异性启动子cTNT来启动目的基因表达。目前PD-1/PD-L1单抗相关的自身免疫性心肌炎多为药物临床试验的安全性评价的报道，或临床个案报道，只有为数甚少的基础和临床研究，且基础研究中采用的动物模型为PD-1/PD-L1敲除小鼠模型或与放疗等联用所导致的小鼠心脏毒性动物模型，与真实世界PD-1/PD-L1单抗所致的免疫性心肌炎发病机制、病理及临床表现有所差别。
技术实现思路
本专利技术提供一种PD1/PDL1单抗致免疫性心肌炎模型的制备方法及制备的模型，真实模拟应用PD-1/PD-L1单抗发生免疫性心肌炎的患者的发病机制和临床经过，模型更接近于临床患者病理生理状态，成模率高并可通过心脏磁共振来动态监测心肌病变。本专利技术的一个方面，提供一种PD1/PDL1单抗致免疫性心肌炎模型的制备方法，包括通过AAV9介导模型心肌组织高表达PDL1，再对心肌组织高表达PDL1的模型应用PD-1/PD-L1单抗造模。以上所述的制备方法，其中，所述模型为动物模型。以上所述的制备方法，其中，具体步骤包括：(1)PDL1Ig基因重组腺病毒载体的构建；(2)将步骤(1)中构建的载体静脉注射所述动物模型，使所述动物模型心肌组织高表达PDL1，再腹腔注射PD1或PDL1单抗造模。以上所述的制备方法，其中，所述步骤(1)中构建的载体为CD274基因过表达的AAV9腺病毒载体。以上所述的制备方法，其中，所述CD274基因的过表达通过心肌细胞特异性启动子cTNT启动。以上所述的制备方法，其中，所述动物模型为小鼠。以上所述的制备方法，其中，所述小鼠为雄性小鼠。以上任一所述制备方法制备的模型在与自身免疫性心肌炎方向相关用途。有益效果本申请采用PDL1(CD274)过表达的AAV9病毒尾静脉注射小鼠，使心肌组织高表达PDL1，再腹腔注射PD1或PDL1单抗，真实模拟应用PD-1/PD-L1单抗发生免疫性心肌炎的患者的发病机制和临床经过，构建的免疫性心肌炎动物模型，具有成模率高和可动态监测的优点，可用于临床研究PD-1/PD-L1单抗所致的免疫性心肌炎的发病机制、早期预警标志物和治疗等。附图说明图1.本实施例步骤一中构建的包含目的基因的pHBAAV-TNT-3flag-P2A-EGFP(lsz)载体图谱；图2本专利技术实施例中A组小鼠心肌细胞病理切片HE染色和CD3免疫组化：可见心肌细胞肌丝溶解，巨噬细胞增多，T细胞浸润，巨细胞存在；图3本专利技术实施例中A组小鼠心肌细胞病理切片HE染色和CD3免疫组化：再示T细胞浸润；图4本专利技术实施例中A组小鼠心脏磁共振T2加权像长T2信号；图5本专利技术实施例中A组小鼠心脏磁共振T2mapping值增高。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1PDL1Ig基因重组腺病毒载体的构建一、载体构建的主要流程如下：1.选择对应的载体，并进行设计目的片段PCR引物；具体使用的引物序列如下：2.选用合适的限制性内切酶进行酶切载体，琼脂糖凝胶回收得到纯化的线性化载体；根据如下表中顺序依次加入每种试剂，轻轻吸打混匀，置于37℃水浴锅中反应1-2h；酶切结束之后进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段；载体酶切体系如下：注：限制性内切酶使用的量及酶切的时间可根据酶活性进行调整；若是单酶切，则进行相应体系的调整。3.根据设计的引物进行目的片段PCR，琼脂糖凝胶回收得到正确大小的目的片段；4.将线性化载体和目的片段按照同源重组或者T4连接的方法进行连接；5.转化感受态DH5a或者stbl3，菌液涂板，培养12-16h；6.挑选单克隆行进菌落验证；7.选择菌落验证正确的阳性克隆进行测序；8.测序正确的克隆样品进行质粒抽提。二、构建的载体及目的基因信息本实施例步骤一中构建的包含目的基因的pHBAAV-TNT-3flag-P2A-EGF本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种PD1/PDL1单抗致免疫性心肌炎模型的制备方法，其特征在于，包括通过AAV9介导模型心肌组织高表达PDL1，再对心肌组织高表达PDL1的模型应用PD-1/PD-L1单抗造模。/n
【技术特征摘要】
1.一种PD1/PDL1单抗致免疫性心肌炎模型的制备方法，其特征在于，包括通过AAV9介导模型心肌组织高表达PDL1，再对心肌组织高表达PDL1的模型应用PD-1/PD-L1单抗造模。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述模型为动物模型。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
(1)PDL1Ig基因重组腺病毒载体的构建；
(2)将步骤(1)中构建的载体静脉注射所述动物模型，使所述动物模型心肌组织高表达PDL1，再腹腔注射PD1或PDL1单抗造模。
【专利技术属性】
技术研发人员：王怡宁，曲婵娟，王健，李颜玉，周慷，曹剑，林路，李潇，金征宇，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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