一种干细胞分化而成的胰岛细胞、方法、复合物及应用技术

本发明专利技术适用于生物医学技术领域，提供了一种干细胞分化而成的胰岛细胞、方法、复合物及应用。所述的干细胞分化成胰岛细胞的方法，包括以下步骤：提取分离得到具有分化能力、高纯度的脂肪间充质干细胞；采用腺病毒感染方法将PDX‑1基因转入脂肪间充质干细胞；利用诱导剂使脂肪间充质干细胞定向分化为胰岛细胞。本发明专利技术通过腺病毒感染方法联合诱导剂使脂肪间充质干细胞定向分化为胰岛细胞，得到的胰岛细胞簇内高表达胰岛素（INS）重组蛋白，且诱导结束后大部分细胞仍然高表达PDX‑1蛋白，说明诱导的细胞具有分泌胰岛素（INS）重组蛋白的能力，且效率高；将胰岛细胞搭载细胞支架复合物移植到骨骼肌部位，可较好的治疗糖尿病。

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞分化而成的胰岛细胞、方法、复合物及应用
本专利技术属于生物医学
，尤其涉及一种干细胞分化而成的胰岛细胞、方法、复合物及应用。
技术介绍
随着人民生活水平的不断提高，全球糖尿病发病率逐年提高。糖尿病主要表现为胰岛素的相对或绝对缺乏，同时伴随持续性高血糖为主要特征的慢性代谢性疾病，此外，还可能引发一系列的并发症，如糖尿病肾病、糖尿病大血管病变等，在严重影响人民生活质量的同时也给国民经济带来了巨大压力。目前糖尿病的治疗方法主要是依靠胰岛素、口服降糖药物，或者异体胰岛移植，无论哪种方式，都存在一定程度上的隐患以及不便，胰岛移植对于患者来说更可能存在经济、供体以及免疫排斥等诸多方面的问题。因此，亟需寻找一种可以缓解糖尿病人群血糖水平，同时又安全有效的治疗方法。近年来随着各种类型的干细胞被相继发现，脂肪间充质干细胞(ADSCs)作为一种脂肪来源的干细胞，具有易获取、极强的自我更新能力、多分化潜能以及能够分泌多种细胞因子等的特性，同时还有免疫豁免的功能。将未分化的脂肪间充质干细胞移植进入体内可能会增加致瘤风险，而目前将诱导的胰岛素分泌细胞效率较低，导致治疗糖尿病的效果仍需进一步提升。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供一种干细胞分化而成的胰岛细胞、方法、复合物及应用，旨在解决
技术介绍
中指出的现有技术存在的问题。本专利技术实施例是这样实现的，一种干细胞分化成胰岛细胞的方法，包括以下步骤：提取分离得到具有分化能力、高纯度的脂肪间充质干细胞；采用腺病毒感染方法将PDX-1基因转入脂肪间充质干细胞；利用诱导剂使脂肪间充质干细胞定向分化为胰岛细胞。作为本专利技术实施例的另一种优选方案，所述诱导剂包括诱导剂Ⅰ、诱导剂Ⅱ和诱导剂Ⅲ；诱导剂Ⅰ包括细胞培养添加剂、纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子；诱导剂Ⅱ包括白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸盐、肝细胞生长因子、酸和激活素；诱导剂Ⅲ包括促胰岛素分泌肽、酸和激活素。作为本专利技术实施例的另一种优选方案，所述的采用腺病毒感染方法将PDX-1基因转入脂肪间充质干细胞，具体步骤为：取脂肪间充质干细胞培养，待细胞汇合度为85～95％时，加入含有Adv-PDX-1过表达腺病毒的培养基，感染细胞5～7h后更换培养基，并继续培养6～8d。作为本专利技术实施例的另一种优选方案，所述的利用诱导剂使脂肪间充质干细胞定向分化为胰岛细胞，具体步骤为：脂肪间充质干细胞加入蛋白酶消化后，加入含诱导剂Ⅰ的诱导培养液I并继续培养4～6d，期间每40～48h更换一次诱导培养液I；弃去诱导培养液I，加入含诱导剂II的诱导培养液II并继续培养6～8d，期间每40～48h更换一次诱导培养液II；弃去诱导培养液II，加入含诱导剂III的诱导培养液III并继续培养6～8d，期间每40～48h更换一次诱导培养液III，6～8d后得到目标细胞簇。本专利技术实施例的另一目的在于提供一种所述的方法得到的胰岛细胞。本专利技术实施例的另一目的在于提供一种复合物，包括所述的胰岛细胞和细胞支架。作为本专利技术实施例的另一种优选方案，所述的细胞支架为PDA-PLGA-Hydrogel细胞支架；所述的PDA-PLGA-Hydrogel细胞支架的采用水凝胶作为支架填充物填充在PDA-PLGA细胞支架中。本专利技术实施例的另一目的在于提供一种所述的复合物在制备治疗糖尿病药物中的应用。作为本专利技术实施例的另一种优选方案，将细胞支架搭载胰岛细胞复合物移植到骨骼肌部位。本专利技术通过腺病毒感染方法联合诱导剂使脂肪间充质干细胞定向分化为胰岛细胞，得到的胰岛细胞簇内高表达胰岛素(INS)重组蛋白，且诱导结束后大部分细胞仍然高表达PDX-1蛋白，说明诱导的细胞具有分泌胰岛素(INS)重组蛋白的能力，且效率高；得到的胰岛细胞于30mM葡萄糖刺激下与3.0mM葡萄糖刺激下相比，胰岛素的分泌量有显著性差异；将胰岛细胞搭载细胞支架复合物移植到骨骼肌部位，可较好的治疗糖尿病。附图说明图1为体外大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)感染Ad-PDX-1-GFP7d后的蛋白表达情况；图2为体外脂肪间充质干细胞(ADSCs)诱导过程中的形态变化图；图3为体外诱导结束后细胞簇经双硫腙染色法鉴定后的结果图；图4为体外诱导结束后细胞簇经INS及PDX-1双标后的免疫荧光染色结果图；图5为体外诱导结束后细胞簇的胰岛素分泌结果示意图。图6为干细胞诱导的胰岛细胞与细胞支架复合物移植后大鼠空腹血糖；图7为胰岛细胞与细胞支架复合物的病理检测结果；图8为胰岛细胞与细胞支架复合物的胰岛素免疫荧光结果；图9为胰岛细胞与细胞支架复合物的CD31免疫荧光结果；图10为pHBAD-EF1-MCS-3flag-CMV-EGFP-Δloxp载体图谱；图11为合成质粒酶切的验证结果；图12为正向测序结果；图13为反向测序结果。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。以下结合具体实施例对本专利技术的具体实现进行详细描述。实施例1该实施例提供了一种干细胞分化成胰岛细胞的方法，包括以下步骤：(1)提取分离得到具有分化能力、高纯度的脂肪间充质干细胞；(2)取脂肪间充质干细胞(ADSCs)，以4×105个/孔的细胞数于六孔板中铺板培养，待细胞汇合度为90％左右时，弃去培养基I，加入含有Adv-PDX-1过表达腺病毒的培养基感染细胞6h后更换新鲜培养基I，并置于培养箱中继续培养7d，培养基I包括：培养液(L-DMEM)+10％北美胎牛血清(GibcoFBS)，Adv-PDX-1为插入了大鼠PDX-1基因的CDS区的重组腺病毒，CDS区序列如序列表1所示。7d后，如图1所示，脂肪间充质干细胞(ADSCs)在经过感染量MOI＝100的Adv-PDX-1-GFP的腺病毒感染后，绿色荧光蛋白表达量在90％以上，说明腺病毒对该细胞感染效率高，细胞内成功翻译PDX-1蛋白；(3)弃去培养基I，用PBS清洗两次，再加入含0.53mMEDTA的0.25％胰蛋白酶(Trypsin)消化后，加入诱导培养液I并继续培养5d，期间每44h更换一次诱导培养液I，诱导培养液I包括：DMEM/F12培养基、20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、100ng/ml的表皮细胞生长因子、2％的B27细胞培养添加剂(B27Supplement)；(4)弃去诱导培养液I，加入诱导培养液II并继续培养7d，期间每45h更换一次诱导培养液II，诱导培养液II包括：DMEM/F12培养基、1％的fattyacidfree-BSA(无脂肪酸牛血清白蛋白)、1％的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(ITS)、2nM的重组人激活素A、5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种干细胞分化成胰岛细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n提取分离得到具有分化能力、高纯度的脂肪间充质干细胞；/n采用腺病毒感染方法将PDX-1基因转入脂肪间充质干细胞；/n利用诱导剂使脂肪间充质干细胞定向分化为胰岛细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种干细胞分化成胰岛细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取分离得到具有分化能力、高纯度的脂肪间充质干细胞；
采用腺病毒感染方法将PDX-1基因转入脂肪间充质干细胞；
利用诱导剂使脂肪间充质干细胞定向分化为胰岛细胞。


2.根据权利要求1所述的干细胞分化成胰岛细胞的方法，其特征在于，所述诱导剂包括诱导剂Ⅰ、诱导剂Ⅱ和诱导剂Ⅲ；
诱导剂Ⅰ包括细胞培养添加剂、纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子；
诱导剂Ⅱ包括白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸盐、肝细胞生长因子、酸和激活素；
诱导剂Ⅲ包括促胰岛素分泌肽、酸和激活素。


3.根据权利要求1所述的干细胞分化成胰岛细胞的方法，其特征在于，所述的采用腺病毒感染方法将PDX-1基因转入脂肪间充质干细胞，具体步骤为：
取脂肪间充质干细胞培养，待细胞汇合度为85~95%时，加入含有Adv-PDX-1过表达腺病毒的培养基，感染细胞5~7h后更换培养基，并继续培养6~8d。


4.根据权利要求1所述的干细胞分化成胰岛细胞的方法，其特征在于，所述的利用诱导剂使脂肪间充质干细胞定向分化为胰岛细胞，具体步骤为：

【专利技术属性】
技术研发人员：陈立，张明，张文友，邵丹，杨雪晗，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22