一种表皮干细胞的分离及培养方法和细胞悬液技术

本发明专利技术涉及一种表皮干细胞的分离及培养方法，包括：取大于或等于预设大小的初始皮片，进行预处理得到第一中间皮片；进行清洗得到第二中间皮片；放入混合消化液中，并置于恒温摇床进行消化得到第三中间皮片，混合消化液包括胰蛋白酶和乙二胺四乙酸，其中胰蛋白酶的质量体积比为0.5％～1.25％，消化时间为45～90min；取出第三中间皮片，刮取解离细胞；收集解离细胞得到细胞悬液，进行离心，弃上清；利用完全无血清角质形成细胞培养基进行细胞重悬，得到重悬细胞培养液；将重悬细胞培养液置于用人胎盘Ⅳ型胶原铺板的培养皿中，按照预设时间进行换液，待细胞长满培养皿的70～80％进行传代培养。通过所述方法能够兼顾分离速度和分离比率，且能够提高细胞增殖能力。

【技术实现步骤摘要】
一种表皮干细胞的分离及培养方法和细胞悬液
本专利技术涉及组织工程
，具体涉及一种表皮干细胞的分离及培养方法。本专利技术还涉及该方法制备出的表皮干细胞悬液。
技术介绍
创面是正常皮肤(组织)的完整性被破坏以及一定量正常组织丢失后形成的表面。目前临床上用来覆盖创面的材料主要有患者自体皮、异体皮或异种皮，另外还有自体表皮细胞培养的表皮。但是，上述各种来源的皮各自均存在明显不足，如自体皮存在皮源不足的问题，异体皮或异种皮存在排斥反应的问题，培养表皮存在时间长、易感染、费用昂贵、弹性差等问题。故而，基于组织工程技术构建复合型人工皮肤，已成为当代烧伤医学及组织工程学的一大热点。人工皮肤的构建需要分离种子细胞，目前用于分离表皮细胞的较为快速的方法主要是酶消化法。酶消化法主要包括直接消化法和表皮真皮分离法，其中，直接消化法是将皮肤剪碎，然后用酶进行消化，消化完成后进行纯化步骤实现表皮细胞和真皮细胞的分离，以获得表皮细胞；表皮真皮分离法是先用消化液将表皮和真皮分离，然后对表皮进行消化，以获得表皮细胞。两种酶消化法各有优缺点，表皮真皮分离法分离得到的表皮细胞中干细胞比率相对较高，但需过夜消化，从取材到成功分离细胞需一天的时间，消化时间长；直接消化法分离时间短，但在消化后需要进行纯化步骤，操作过程繁琐。另外，在分离细胞后的培养过程中，需要在培养基中添加重组人表皮生长因子(recombinanthumanepithelialgrowthfactor，rhEGF)，以刺激细胞增殖，但促进作用是有限的，现有技术很难进一步提高细胞增殖能力。因此，如何提高表皮干细胞的分离和培养效率成为亟待解决的技术问题。
技术实现思路
基于上述现状，本专利技术的主要目的在于提供一种表皮干细胞的分离及培养方法，以提高表皮干细胞的分离和培养效率。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术的第一方面提供了一种表皮干细胞的分离及培养方法，包括以下步骤：S100，取大于或等于预设尺寸的初始皮片并进行预处理得到第一中间皮片，预处理包括去除初始皮片的多余皮下脂肪、筋膜及血管；S200，对第一中间皮片进行清洗得到第二中间皮片；S300，将第二中间皮片放入混合消化液中，并置于恒温摇床进行消化得到第三中间皮片，混合消化液包括胰蛋白酶和乙二胺四乙酸，其中胰蛋白酶的质量体积比为0.5％～1.25％，消化时间为45～90min；S400，取出第三中间皮片，并将第三中间皮片置于乳酸林格氏液培养皿中，第三中间皮片的表皮背离乳酸林格氏液培养皿的底部，由上至下刮取解离细胞，解离细胞包括表皮细胞和真皮细胞；S500，收集解离细胞并分散于乳酸林格氏液培养皿中，得到细胞悬液，对细胞悬液进行离心处理，弃上清，保留沉淀的解离细胞；S600，将沉淀的解离细胞置置于完全无血清角质形成细胞培养基中进行重悬，得到重悬细胞培养液；S700，将重悬细胞培养液置于预先用人胎盘Ⅳ型胶原铺板的培养皿中，按照预设时间进行换液处理，待细胞长至培养皿的70～80％进行传代培养。优选地，在步骤S300中，混合消化液中的胰蛋白酶的质量体积比为0.75％～1.0％，所述消化时间为60～75min。进一步优选为混合消化液中的胰蛋白酶的质量体积比为1％，乙二胺四乙酸的质量体积比为0.1％，恒温摇床的温度为37℃，消化时间为1h。优选地，在步骤S300中，每平方厘米初始皮片添加2-4ml的混合消化液。优选地，恒温摇床的转速为80-120rpm。进一步优选为，100rpm。优选地，在步骤S200中对第一中间皮片进行清洗包括：先用双抗溶液清洗一次，再用磷酸盐溶液清洗多次，其中，双抗溶液中，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为0.1mg/ml。优选地，在步骤S100中，所述预设尺寸为大于8cm2。优选地，在步骤S600中，完全无血清角质形成细胞培养基为：在基础无血清角质形成的细胞培养基中添加重组人生长因子、青霉素和链霉素。进一步优选为，细胞培养基中添加的重组人生长因子浓度为0.005μg/ml。优选地，在步骤S700中，每平方厘米铺板添加1.0-3.0μg的人胎盘Ⅳ型胶原。进一步优选为，每平方厘米铺板添加2.0μg的人胎盘Ⅳ型胶原。优选地，在步骤S700中，按照预设时间进行换液处理，包括：将重悬细胞培养液置于预先用人胎盘Ⅳ型胶原铺板的培养皿24h后，待细胞贴壁换液一次，之后每2～3天换液一次。本专利技术第二方面提供了一种表皮干细胞悬液，采用本专利技术第一方面提供的方法制备，用于皮肤创伤愈合。本专利技术提供的表皮干细胞的分离及培养方法，在消化过程中由于初始皮片带有真皮层，通过综合控制胰蛋白酶的浓度、反应时间等反应条件，使得消化后引入了适量的真皮成纤维细胞，且引入的真皮成纤维细胞的量不会与表皮干细胞形成竞争或与表皮干细胞形成的竞争较小，而该部分真皮成纤维细胞分泌的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或通过促分裂效应和非促分裂的激素样活性，特别是通过激活角膜基质成纤维细胞分裂增殖活性，使胶原纤维分泌增加、毛细血管增多和管腔扩张，即促进血管内皮细胞增殖分化，诱导毛细血管内皮细胞侵入三维胶原基质中，形成类似于毛细血管的管样结构，促进皮肤层血管新生。在此基础上，对患者创面位置的血液循环进行改善，提升肉芽生成的速度，使修复组织的强度和结构能够得到有效优化，并且碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)还能够将激活吞噬细胞的功能激活，使受损物质能够具有较强的抗感染能力，加快患者创面位置愈合的速度，为组织生长提供一个趋于稳定的符合表皮细胞生长的细胞外环境，进一步促进表皮干的细胞增殖能力。相对于表皮真皮分离法，本专利技术无需过夜消化，大大缩短了消化时间；相比于直接消化法，直接对皮片进行消化，不将皮片剪碎成小块，并配合合适的消化液浓度和消化时间，避免了皮片中真皮层的过度消化，无需进行纯化步骤，简化分离过程；且通过添加合适生物蛋白的细胞重悬液，使得分散的表皮细胞可以较为理想地与创面贴附以获得良好的细胞利用率，表皮细胞进一步依靠部分重悬液或创面分泌的体液中的各种营养物质及生物活性蛋白因子进行增殖运动及细胞分化，提高创面修复效果。本专利技术的其他有益效果，将在具体实施方式中通过具体技术特征和技术方案的介绍来阐述，本领域技术人员通过这些技术特征和技术方案的介绍，应能理解所述技术特征和技术方案带来的有益技术效果。附图说明以下将参照附图对根据本专利技术提供的表皮干细胞的分离及培养方法的优选实施方式进行描述。图中：图1为根据本专利技术提供的一种表皮干细胞的分离及培养方法的流程图。具体实施方式通过下面的实施例可以对本专利技术进行进一步的描述，然而，本专利技术的范围并不限于下述实施例。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。在本文中，提及的PBS缓冲液或者PBS溶液或者PBS等，如无特别说明，均是指磷酸盐缓冲液。在本文中，提及的双抗溶液或双抗，如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表皮干细胞的分离及培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/nS100，取大于或等于预设尺寸的初始皮片并进行预处理得到第一中间皮片，所述预处理包括去除所述初始皮片的多余皮下脂肪、筋膜及血管；/nS200，对所述第一中间皮片进行清洗得到第二中间皮片；/nS300，将所述第二中间皮片放入混合消化液中，并置于恒温摇床进行消化得到第三中间皮片，所述混合消化液包括胰蛋白酶和乙二胺四乙酸，其中胰蛋白酶的质量体积比为0.5％～1.25％，消化时间为45～90min；/nS400，取出所述第三中间皮片，将所述第三中间皮片置于乳酸林格氏液培养皿中，使所述第三中间皮片的表皮背离所述乳酸林格氏液培养皿的底部，由上至下刮取解离细胞，所述解离细胞包括表皮细胞和真皮细胞；/nS500，收集所述解离细胞并分散于所述乳酸林格氏液培养皿中，得到细胞悬液，对所述细胞悬液进行离心处理，弃上清，保留沉淀的解离细胞；/nS600，将所述沉淀的解离细胞置于完全无血清角质形成细胞培养基中进行重悬，得到重悬细胞培养液；/nS700，将所述重悬细胞培养液置于预先用人胎盘Ⅳ型胶原铺板的培养皿中，按照预设时间进行换液处理，待细胞长至所述培养皿的70～80％进行传代培养。/n...

【技术特征摘要】
1.一种表皮干细胞的分离及培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S100，取大于或等于预设尺寸的初始皮片并进行预处理得到第一中间皮片，所述预处理包括去除所述初始皮片的多余皮下脂肪、筋膜及血管；
S200，对所述第一中间皮片进行清洗得到第二中间皮片；
S300，将所述第二中间皮片放入混合消化液中，并置于恒温摇床进行消化得到第三中间皮片，所述混合消化液包括胰蛋白酶和乙二胺四乙酸，其中胰蛋白酶的质量体积比为0.5％～1.25％，消化时间为45～90min；
S400，取出所述第三中间皮片，将所述第三中间皮片置于乳酸林格氏液培养皿中，使所述第三中间皮片的表皮背离所述乳酸林格氏液培养皿的底部，由上至下刮取解离细胞，所述解离细胞包括表皮细胞和真皮细胞；
S500，收集所述解离细胞并分散于所述乳酸林格氏液培养皿中，得到细胞悬液，对所述细胞悬液进行离心处理，弃上清，保留沉淀的解离细胞；
S600，将所述沉淀的解离细胞置于完全无血清角质形成细胞培养基中进行重悬，得到重悬细胞培养液；
S700，将所述重悬细胞培养液置于预先用人胎盘Ⅳ型胶原铺板的培养皿中，按照预设时间进行换液处理，待细胞长至所述培养皿的70～80％进行传代培养。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S300中，所述混合消化液中的胰蛋白酶的质量体积比为0.75％～1.0％，所述消化时间为60～75min。


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【专利技术属性】
技术研发人员：万绵水，林创鑫，
申请(专利权)人：万绵水，
类型：发明
国别省市：广东;44