一种外泌体捕获纸芯片及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种外泌体捕获纸芯片及其制备方法与应用，该外泌体捕获纸芯片的纸纤维表面附着有正电荷纳米粒子，正电荷纳米粒子上固定有外泌体特异性标记物的抗体，其中，正电荷纳米粒子为ZIF‑90纳米颗粒，外泌体特异性标记物的抗体为CD63抗体。本发明专利技术中的外泌体捕获纸芯片相较于常规分离方法外泌体分离效率更高，操作更简单，无需大型仪器，耗时短，捕获的外泌体的纯度相较于常规方法更高。

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体捕获纸芯片及其制备方法与应用
本专利技术属于生化分析与生物传感领域，具体涉及一种外泌体捕获纸芯片及其制备方法与应用。
技术介绍
细胞外囊泡(EVs)是由细胞释放到细胞外空间的膜结构，并携带有核酸和蛋白质等物质。EVs有多种类型，如微囊泡、凋亡小体、外泌体等。外泌体是小的EVs，直径在30～150nm左右，是大多数真核细胞分泌的具有膜结构的内源性纳米小泡(30-150nm)。外泌体在介导细胞间通讯和调节多种生物过程中能发挥重要作用，而且，由于外泌体具有良好的生物相容性，跨膜性能以及可以作为潜在的生物标志物，从而可被广泛应用于药物载体，疾病的早期诊断和靶向治疗等众多领域。外泌体的研究基础是建立高效的外泌体分离方法。然而，由于外泌体在样本中通常与尺寸和密度接近的微囊泡、凋亡小体、脂蛋白等复杂样本共存，对其有效分离存在巨大挑战。在相关技术中，存在部分可以用于外泌体分离富集的方法，如超高速离心法、密度梯度离心法、尺寸排阻法、聚合物沉淀法以及微流控法等，但各有弊端。超高速离心法需要大型且价格昂贵的超高速离心机，操作繁琐耗时(～8h)，而且容易产生机械力损伤，产率低。尺寸排阻法和聚合物沉降法虽然产率高、价格低、操作简单，但其选择性差，获得的外泌体纯度低。基于微流控的方法也被广泛应用于外泌体的分离和检测，但其需要复杂的微流控芯片，微流控芯片价格昂贵，制作工艺复杂且分离产率低，样本处理量极小，不适用于大规模生产。因此，开发一种简便、高效的外泌体捕获方法，以获得高纯度的外泌体，将对促进外泌体的研究具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种外泌体捕获纸芯片及其制备方法与应用，本专利技术利用纸芯片原位生长ZIF-90纳米粒子共价交联CD-63，提高抗体有序性和负载率原理，结合多孔滤膜，能够高效、快速和高纯度捕获和无损释放各类样品中的外泌体，解决了现有外泌体提取方法中存在的问题。本专利技术的第一个方面，提供一种外泌体捕获纸芯片，该外泌体捕获纸芯片的纸纤维表面附着有正电荷纳米粒子；该正电荷纳米粒子上固定有外泌体特异性标记物的抗体。纸芯片(Microfluidicpaper-baseddevices，μPAD)又叫纸上实验室(Labonapaper)，其成本低廉、制备简单、使用方便、生物相容性好，可被应用于食品安全分析、环境监测以及生物医药分析等多个行业。根据本专利技术的第一个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述正电荷纳米粒子具有-CHO基团。正电荷纳米粒子表面的-CHO基团可以与抗体所带-NH2基团发生反应，使两者结合在一起，从而得到固定有抗体的外泌体捕获纸芯片。在本专利技术的一些优选实施方式中，正电荷纳米粒子包括ZIF-90纳米颗粒。在本专利技术的一些更优选实施方式中，正电荷纳米粒子为ZIF-90纳米颗粒。由于纸纤维表面带大量负电荷，ZIF-90纳米颗粒中带正电荷的Zn2+容易和纸纤维发生较强的静电结合，而且由于采用了咪唑-2-甲醛(HICA)作为反应液，HICA与纸纤维表面的Zn2+发生配位反应，使反应液中游离的Zn2+能继续作为ZIF-90的Zn源实现ZIF-90在纸芯片上的原位生长。根据本专利技术的第一个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述外泌体特异性标记物的抗体包括外泌体蛋白抗体和外泌体核酸抗体。在本专利技术的一些优选实施方式中，所述外泌体特异性标记物的抗体为外泌体蛋白抗体。在本专利技术的一些优选实施方式中，所述外泌体蛋白包括CD63、CD81和CD69。在本专利技术的一些更优选实施方式中，所述外泌体蛋白为CD63。本专利技术的第二个方面，提供本专利技术第一个方面所述外泌体捕获纸芯片的制备方法，包括如下步骤：(1)将纸浸入Zn(NO3)2·6H2O甲醇溶液浸泡30～35min，然后在Zn(NO3)2·6H2O、咪唑-2-甲醛和甲醇的混合液中浸泡8～8.5h，甲醇洗涤，干燥；(2)向干燥后的纸上滴加外泌体蛋白抗体，反应6～6.5h，磷酸盐吐温缓冲液洗涤，即得。根据本专利技术的第二个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述外泌体蛋白抗体包括CD63抗体。在本专利技术的一些优选实施方式中，所述外泌体蛋白抗体为CD63抗体。根据本专利技术的第二个方面，在本专利技术的一些实施方式中，步骤(1)中纸在Zn(NO3)2·6H2O甲醇溶液以及在Zn(NO3)2·6H2O、咪唑-2-甲醛和甲醇混合液中的浸泡温度均为85～95℃。在本专利技术的一些优选实施方式中，纸在Zn(NO3)2·6H2O甲醇溶液以及在Zn(NO3)2·6H2O、咪唑-2-甲醛和甲醇混合液中的浸泡温度均为90℃。根据本专利技术的第二个方面，在本专利技术的一些实施方式中，步骤(1)中所述Zn(NO3)2·6H2O甲醇溶液中Zn(NO3)2·6H2O的摩尔浓度为8～12mmol/L。在本专利技术的一些优选实施方式中，Zn(NO3)2·6H2O甲醇溶液中Zn(NO3)2·6H2O的摩尔浓度为10mmol/L。根据本专利技术的第二个方面，在本专利技术的一些实施方式中，步骤(1)中所述Zn(NO3)2·6H2O、咪唑-2-甲醛和甲醇混合液中Zn(NO3)2·6H2O和咪唑-2-甲醛的摩尔浓度比为1：(3～5)。在本专利技术的一些优选实施方式中，Zn(NO3)2·6H2O、咪唑-2-甲醛和甲醇混合液中Zn(NO3)2·6H2O和咪唑-2-甲醛的摩尔浓度比为1:4，Zn(NO3)2·6H2O的摩尔浓度为5mmol/L，咪唑-2-甲醛的摩尔浓度为20mmol/L。本专利技术的第三个方面，提供一种外泌体捕获检测系统，该外泌体捕获检测系统包括驱动装置、储存装置、大孔径分离膜、本专利技术第一个方面所述的外泌体捕获纸芯片或本专利技术的第二个方面制备方法制备得到的外泌体捕获纸芯片。根据本专利技术的第三个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述大孔径分离膜的孔径小于等于200nm。在本专利技术的一些优选实施方式中，所述大孔径分离膜包括聚碳酸酯膜(PC)。在本专利技术的一些更优选实施方式中，所述大孔径分离膜为聚碳酸酯膜。采用200nm孔径的聚碳酸酯膜主要用于初步筛除样本中粒径大于200nm的微囊泡等大颗粒，使外泌体捕获纸芯片能更高效的捕获外泌体。根据本专利技术的第三个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述驱动装置为蠕动泵。根据本专利技术的第三个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述储存装置为带有流动控制阀的储液装置，以用于储存样品溶液，洗脱液和洗涤液。本专利技术中的外泌体捕获检测系统，在蠕动泵的驱动下，样品中的大于200nm的大囊泡颗粒被PC膜截留，小于200nm的颗粒经过μPAD层时，由于μPAD表面原位修饰结构规则且表面富含醛基的ZIF-90纳米材料能够有序共价修饰外泌体特异性抗体CD-63，提高了抗体的结合效率，使外泌体被μPAD上高密度的CD63抗体特异性捕获。捕获完成后，可以利用谷胱甘肽(GSH)水解ZIF-90纳米材料(MOF)，将外泌体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外泌体捕获纸芯片，其特征在于，所述外泌体捕获纸芯片的纸纤维表面附着有正电荷纳米粒子；/n其中，所述正电荷纳米粒子上固定有外泌体特异性标记物的抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种外泌体捕获纸芯片，其特征在于，所述外泌体捕获纸芯片的纸纤维表面附着有正电荷纳米粒子；
其中，所述正电荷纳米粒子上固定有外泌体特异性标记物的抗体。


2.根据权利要求1所述的外泌体捕获纸芯片，其特征在于，所述正电荷纳米粒子具有-CHO基团，所述正电荷纳米粒子优选包括ZIF-90纳米颗粒。


3.根据权利要求1所述的外泌体捕获纸芯片，其特征在于，所述外泌体特异性标记物的抗体包括外泌体蛋白抗体和外泌体核酸抗体；所述外泌体特异性标记物的抗体优选为外泌体蛋白抗体；所述外泌体蛋白包括CD63、CD81和CD69，所述外泌体蛋白优选为CD63。


4.权利要求1～3任一项所述的外泌体捕获纸芯片的制备方法，包括如下步骤：
(1)将纸浸入Zn(NO3)2·6H2O甲醇溶液浸泡30～35min，然后在Zn(NO3)2·6H2O、咪唑-2-甲醛和甲醇的混合液中浸泡8～8.5h，甲醇洗涤，干燥；
(2)向干燥后的纸上滴加外泌体蛋白抗体，反应6～6.5h，磷酸盐吐温缓冲液洗涤，即得；其中，所述外泌体蛋白抗体包括CD63抗体，所述外泌体蛋白抗体优选为CD63抗体。


5.根据权利要求4所述的外泌体捕获纸芯片的制备方法，其特征在于，步骤(1)中纸在Zn(NO3)2·6H2O甲醇溶液以及在Zn(NO3)2·6H2O、咪唑-2-甲醛和甲醇混合...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴宗，张立，邹小勇，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44