miR-106a-5p模拟物在制备骨缺损修复药物中的应用制造技术

本发明专利技术具体涉及一种miR‑106a‑5p模拟物在制备骨缺损修复药物中的应用，属于骨修复材料领域。本发明专利技术所提供的miR‑106a‑5p模拟物通过下调Fam134a，解除Fam134a对Alp、Sp7、Col1a1和Runx2基因表达的抑制，促进成骨细胞分化与成熟，实现骨缺损修复，为促进骨缺损修复提供了新的研究方向。

Application of mir-106a-5p simulant in the preparation of drugs for bone defect repair

【技术实现步骤摘要】
miR-106a-5p模拟物在制备骨缺损修复药物中的应用
本专利技术属于骨修复材料领域，具体为一种miR-106a-5p模拟物在制备骨缺损修复药物中的应用。
技术介绍
然而因创伤、炎症、感染、骨病或手术所致的骨质短缺，称为骨缺损。由于骨缺损的存在，常造成骨不连接，延迟愈合或不愈合，及局部的功能障碍。骨缺损在临床上发病率较高，治疗难度大，是骨科临床上的难题之一。骨是一种具有机械运动功能和代谢功能的器官，骨稳态的维持主要依靠成骨细胞(osteoblast,OB)与破骨细胞(Osteoclast,OC)之间功能的平衡以及两种细胞的互相协调，当成骨细胞功能过度活跃时骨稳态倾向于骨形成，而当破骨细胞功能过度活跃时骨稳态则偏向于骨吸收。骨缺损修复过程包括骨的分解吸收与新骨的形成。破骨细胞负责骨分解与吸收，而成骨细胞负责新骨形成。破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，主要由内外骨膜和骨髓中基质内的间充质始祖细胞分化而来，能特异性分泌多种生物活性物质，调节并影响骨的形成和重建过程。微小RNA(miRNA)是内源性小非编码RNA，能够与靶mRNA的3'UTR结合，从而进一步以依赖于RNA诱导的沉默复合物(RISC)的方式促进mRNA降解。miRNA在许多生理和病理条件下的胚胎发育，肿瘤进展，免疫调节和其他生物过程中起着至关重要的调节作用。在骨骼重塑过程中，miRNA也参与多个过程，例如调节骨骼细胞的分化并介导骨骼细胞之间的细胞间通讯。首先发现miRNA存在于细胞质中。最近的研究报道它们也存在于细胞外空间中，主要由于它们被包裹在细胞外囊泡(EVs)中而受到保护而不受RNase降解的影响。这些RNA可以通过细胞外囊泡的内在化从亲代细胞转移到受体细胞中，充当细胞间通讯工具。根据细胞外囊泡的大小大致分为两种亚型，细胞外大囊泡电动汽车(lEVs；也称为微囊泡)和细胞外小囊泡(sEVs；也称为外泌体)，sEVs的直径小于200nm，而lEVs通常大于200nm。在骨骼微环境中，囊泡也被认为是骨细胞之间信号转导的重要媒介。但是，还未有报导囊泡介导的miR-106a-5p在细胞间通讯的研究，其在骨骼系统中的作用更是鲜有报道，尚未见到关于miR-106a-5p在制备促进骨缺损修复药物的任何报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术目的之一在于提供一种miR-106a-5p模拟物在制备骨缺损修复药物中的应用，本专利技术目的之二在于提供一种负载miR-106a-5p模拟物的药物载体，本专利技术目的之三在于提供所述药物载体在制备骨缺损修复药物中的应用，本专利技术目的之四在于提供一种负载miR-106a-5p模拟物的药物载体的DBM支架，本专利技术目的之四在于提供所述DBM支架在制备骨修复材料中的应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、miR-106a-5p模拟物在制备骨缺损修复药物中的应用，所述miR-106a-5p模拟物的核苷酸序列为SEQIDNO.1。作为优选的技术方案之一，所述miR-106a-5p模拟物诱导成骨分化基因Alp、Sp7、Colla1和Runx2的表达。作为优选的技术方案之一，所述诱导的方法为下调Fam134a的表达，解除Fam134a对Alp、Sp7、Colla1和Runx2基因表达的抑制。2、负载miR-106a-5p模拟物的药物载体，所述miR-106a-5p模拟物的核苷酸序列为SEQIDNO.1。作为优选的技术方案之一，所述药物载体为细胞外小囊泡。3、所述药物载体在制备骨缺损修复药物中的应用。4、一种负载miR-106a-5p模拟物的药物载体的DBM支架。5、所述DBM支架在制备骨修复材料中的应用。本专利技术的有益效果在于：miR-106a-5p模拟物在体外促进骨髓间充质干细胞BMSCs向成骨分化，同时sEVs可以保护miR-106a-5p模拟物不受RNase降解的影响。利用Targetscan软件发现与miR-106a-5p相互作用的靶基因Fam134a与成骨细胞增殖、分化相关；通过双荧光素酶报告基因、茜素红染色和荧光实时定量PCR技术等检测判断miR-106a-5p模拟物对成骨细胞分化的影响与作用机制，结果发现，miR-106a-5p通过调控Fam134a促进成骨细胞分化；将包裹了miR-106a-5p模拟物的sEVs负载到脱钙骨基质(DBM)支架，利用microCT观察支架复合材料对颅骨缺损的修复效果，并利用OCN免疫组织化学观察修复区域的局部成骨情况，结果显示负载miR-106a-5p模拟物组颅骨缺损修复显著优于对照组，且修复区域中OCN阳性着色显著高于对照组，这表明负载miR-106a-5p模拟物的sEVs可以促进成骨细胞分化成熟进而促进骨缺损修复。因此，本专利技术为促进骨缺损修复提供了新的研究方向。附图说明图1为miR-106a-5p模拟物对骨髓间充质干细胞成骨分化影响结果，A为转染miR-106a-5p模拟物的MSCs细胞成骨分化14天的茜素红染色结果；B为钙沉积区域统计结果，*(p<0.05)或**(p<0.01)用于指示两组之间差异的显着性。图2为sEVs保护miR-106a-5p模拟物不受RNase降解结果图。图3为miR-106a-5p模拟物抑制剂对成骨分化的影响结果，A为miR-106a-5p模拟物或抑制剂转导的sEVs刺激下14天，MSCs细胞茜素红染色结果；B为钙沉积区域统计结果。图4为miR-106a-5p模拟物或抑制剂转导的sEVs刺激下，MSCs成骨分化14天后标志基因Alp、Sp7、Colla1和Runx2的表达情况，miR-NC-sEVs和si-NC-sEVs为对照组，miR-106a-5p-sEVs表示miR-106a-5p过表达组，si-miR-106a-5p-sEVs表示miR-106a-5p抑制组。图5为双荧光报告系统检测miR-106a-5p与Fam134a的靶向关系结果图，A为Fam134a3'UTR野生型(wt)和突变型(mut)荧光素酶报告基因载体的构建，B为与miR-106a-5p模拟物共转染后，包含Fam134a3'UTR的报告基因的相对荧光素酶活性，C为qRT-PCR显示Fam134a在过表达或敲低miR-106a-5p的BMSC中的相对表达水平。图6为转染Fam134a和干扰Fam134a质粒后，刺激MSCs成骨分化14天后标志基因Alp、Sp7、Colla1和Runx2的表达情况，Vehicle和si-Vehicle为对照组，Fam134a表示Fam134a过表达组，si-Fam134a表示Fam134a抑制组。图7为负载miR-106a-5psEVs的DBM支架对骨缺损修复的影响结果，A为骨缺损部位microCT重建图像，B为总缺损修复区域的骨形成率，骨矿物质密度(BMD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.miR-106a-5p模拟物在制备骨缺损修复药物中的应用，其特征在于，所述miR-106a-5p模拟物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。/n

【技术特征摘要】
1.miR-106a-5p模拟物在制备骨缺损修复药物中的应用，其特征在于，所述miR-106a-5p模拟物的核苷酸序列为SEQIDNO.1。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-106a-5p模拟物诱导成骨分化基因Alp、Sp7、Colla1和Runx2的表达。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述诱导的方法为下调Fam134a的表达，解除Fam134a对Alp、Sp7、Colla1和Runx2基因表达的抑制。

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【专利技术属性】
技术研发人员：马秦雨，吴雨桐，梁蒙蒙，许建中，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50