【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种基于芯片引物表面萃取的基因高通量合成方法
本专利技术涉及基因合成领域,具体涉及芯片引物合成以及基于该芯片引物的基因高通量自动化合成方法。
技术介绍
基因合成通常是基于聚合酶链式组装(PCA)以及聚合酶链式反应(PCR),将预先设计好的引物序列按照两两首尾互补配对的方法拼接成目的基因序列。常规基因合成中的引物是通过柱合成的方式,并将引物逐条混合。由于引物的合成规模(25nmol)远大于基因合成时所需引物的量(50pmol),因此常规基因合成具有通量低、成本高、操作复杂等缺点。为了克服上述缺点而发展出了高通量基因合成方法,该方法依赖于高通量引物合成平台,该平台可将上万条甚至上百万条引物合成在面积仅为几平方厘米至几十平方厘米的芯片上,每条引物的合成规模在fmol级别,极大地降低了引物的合成成本。随后利用诸如特异性PCR等方式将引物分成若干个文库,每个文库中包含合成某一目的基因所需的所有引物序列,在利用诸如酶切的方式除去引物上的标签序列后,将引物文库逐个组装成相应的目的基因(Nature,2004,1050-1054)。该高通量基因合成方法,虽然极大地提升了通量和降低了成本,仍然存在以下问题:1)整体操作流程较为复杂,需要将引物先合并再分组,并经过繁琐的酶切、纯化等操作,自动化程度较低。2)引物利用率低,突变率高。由于需在每条引物两端加上PCR结合位点及酶切位点等序列,因此用于基因合成的引物序列通常仅占引物全长的50%甚至更低,另一方面引物合成长度越长则突变率越高,导致最终基因合成的突变率较高。3)特异性低以及交叉污染风险。所有 ...
【技术保护点】
一种基于芯片引物表面萃取的基因高通量合成方法,所述方法包括将引物按簇分类后合成在芯片的不同区域,氨解方法切割芯片上的引物簇,随后使用液体转移工作站将不同簇的引物溶解并将溶解后的各引物簇分别转移至适于基因合成的独立反应容器中,在适于基因合成的条件下进行基因合成反应,收获合成的目的基因片段。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181106 CN 2018113139097一种基于芯片引物表面萃取的基因高通量合成方法,所述方法包括将引物按簇分类后合成在芯片的不同区域,氨解方法切割芯片上的引物簇,随后使用液体转移工作站将不同簇的引物溶解并将溶解后的各引物簇分别转移至适于基因合成的独立反应容器中,在适于基因合成的条件下进行基因合成反应,收获合成的目的基因片段。
根据权利要求1所述的方法,其中所述按簇分类的引物为编码多个目的基因片段的引物簇,其中每个引物簇包含编码同一个目的基因片段的全部引物。
根据权利要求1或2所述的方法,其中不同引物簇分别在芯片的不同区域内合成,所述不同区域之间留有空白区域;优选地,所述空白区域上合成多个疏水基团。
根据权利要求1-3任一项所述的方法,其中在芯片上合成引物时使每个引物的3’端额外添加至少1个可通过氨解切割的连接臂和至少3个dT作为保护碱基,优选额外添加2个可通过氨解切割的连接臂和5个dT作为保护碱基;所述连接臂选自任何氨解后可以使引物产生3’自由羟基的结构,优选为基于亚磷酰胺结构并能提供3’端自由羟基的结构,更优选为琥珀酰己胺亚磷酰胺。
根据权利要求1-4任一项所述的方法,其中所述氨解方法是用不含水的胺化剂氨解;优选地,所述胺化剂选自氨气、一甲胺,更优选为一甲胺。
根据权利要求5所述的方法,其中所述氨解在充满胺化剂的高压反应容器中进行。
根据权利要求5或6所述的方法,其中所述氨解是在25℃-120℃以及20-120psi的条件下氨解15分钟-4小时;优选地,所述氨解是在80℃以及40psi的条件下氨解3小时。
根据权利要求1-7任一项所述的方法,其中所述液体转移工作站为取样机,所述引物溶解使用的溶剂选自可进行PCR反应的溶剂,优选为TE溶液或蒸馏水,更优选为蒸馏水。
根据权利要求8所述的方法,其中所述引物溶解包括利用取样机向每个引物簇中滴加10-1000nL的溶剂,静置0.5-3分钟后使用针头吹吸使其溶解;优选地,所述引物溶解包括利用取样机向每个引物簇中滴加50nL的蒸馏水,静置1分钟后使用针头吹吸使其溶解。
根据权利要求1-9任一项所述的方法,其中所述适于基因合成的独立反应容器为多孔板的孔,优选为96孔板的孔;所述转移至适于基因合成的独立反应容器中的步骤包括将液体转移工作站的针头高度调整至芯片表面并吸取芯片内溶解液转移至多孔板内;优选地,在吸取芯片内溶解液转移至多孔板内之后,进一步通过清洗程序对取样针头进行清洗,然后重复引物溶解和转移步骤,直至所有引物簇被转移完全。
根据权利要求1-10任一项所述的方法,其中所述在适于基因合成的条件下进行基因合成反应包括向每个独立反应容器中加入基因合成反应液和/或目的基因片段的F/R引物,进行合成反应;所述基因合成反应溶液选自PCA反应液和PCR反应液。
根据权利要求1-11任一项所述的方法,所述基因合成反应包括向每个反应容器中加入PCA反应液,使引物簇进行组装反应,然后加入PCR反应液和目的基因片段的F/R引物,进行PCR反应。
一种基于芯片引物表面萃取的基因高通量合成方法,包括以下步骤:
1)在芯片上合成编码多个目的基因片段的引物簇,其中每个引物簇包含编码同一个目的基因片段的全部引物,编码不同目的基因片段的引物簇分别在芯片的不同区域合成;
2)将合成完成后的芯片进行氨解以将引物从芯片上切割下来,并使切割下来的引物含有3'自由羟基;
3)向每个引物簇滴加溶剂,使该引物簇中的引物充分溶解,收集每个溶解的引物簇并分别转移至独立的反应容器中;
4)在反应容器中加入基因合成反应液,进行基因合成;
5)回收反应产物,得到多个目的基因片段。
根据权利要求13所述的方法,其中所述步骤1)的所述不同区域之间留有空白区域;优选地,所述在所述空白区域上合成多个疏水基团。
根据权利要求13或14所述的方法,其中所述步骤1)中在芯片上合成引物时,各引物的3’端额外添加至少1个可通过氨解切割的连接臂和至少3个dT作为保护碱基,优选额外添加2个可通过氨解切割的连接臂和5个dT作为保护碱基;所述连接臂选自任何氨解后可以使引物产生3’自...
【专利技术属性】
技术研发人员:王建鹏,范玉峰,吴政宪,
申请(专利权)人:南京金斯瑞生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:江苏;32
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