用于真核宿主中真核mRNA生产、输出和翻译的工程细菌系统和方法技术方案

本发明专利技术技术包括用于生成基因工程化的原核生物体的新系统、方法和组合物，所述基因工程化的原核生物体被配置为生产可引入到真核宿主并在真核宿主中翻译的真核样mRNA。其他方面可包括新型真核样核苷酸构建体和mRNA分子，以及从原核细胞有效递送至靶真核宿主细胞的方法和系统。本发明专利技术进一步的方面包括用于真核细胞非整合性转化的系统、方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于真核宿主中真核mRNA生产、输出和翻译的工程细菌系统和方法相关申请的交叉引用本国际PCT申请要求于2018年7月4日提交的美国临时申请第62/693,963号的利益和优先权。将上述申请的全部说明书和附图通过引用全部并入于此。序列表本申请含有以ASCII格式以电子方式提交的序列表，该序列表通过引用全部并入于此。
本专利技术技术包括生成基因工程化的原核生物体的新系统、方法和组合物，所述基因工程化的原核生物体被配置为生产可引入真核宿主并在真核宿主中翻译的真核样mRNA。另外的实施方案可包括新型真核样核苷酸构建体和mRNA分子、促进mRNA转运和翻译的辅助蛋白、以及用于真核细胞高效运输和非整合转化的方法和系统。
技术介绍
经基因修饰的真核生物体发展的一个主要限制因素是制造安全、有效、重要的稳定转基因表达系统是一个困难而漫长的过程。为了开发哪怕是一个转基因真核生物体也可能需要长达十年的时间，并且需要大量的资金投入。为了克服这个问题，有人提出使用原核系统来生产和转移真核样mRNA来改造真核宿主，这使需要的时间大大减少。然而，如下文所讨论，原核和真核转录和翻译系统之间的功能、遗传和调控差异代表了在结合这两个系统以生成新的转基因生物时的重大障碍。细胞的遗传信息以脱氧核糖核酸(DNA)的核苷酸序列储存和递送。这些信息的表达需要将DNA转录成信使核糖核酸(mRNA)分子，所述分子将特定的、精确的信息递送到蛋白合成的细胞质部位。在所有物种中，转录始于在基因中称为启动子的开始处的RNA聚合酶复合物(或全酶)与特殊DNA序列的结合。RNA聚合酶复合物的激活使转录启动，随后是转录物的伸长。反过来，转录物的伸长又导致启动子的清除，转录过程又可以开始。因此，转录可以在两个水平上进行调节：启动子水平(顺式调节)和聚合酶水平(反式调节)。这些因素在细菌和真核生物之间是不同的。在真核细胞中，mRNA是在细胞核中合成的，通常为称为异质核RNA(hnRNA)的较大的前体分子。在原核生物体中，mRNA一经转录就被翻译成蛋白。与真核细胞不同的是，原核生物诸如细菌没有一个将DNA和核糖体分开的独特的细胞核，所以没有立即翻译的障碍。事实上，在电子显微镜术生成的细菌高倍率图像中，可以看到核糖体正在翻译仍在从DNA转录的信使RNA。这个过程在真核细胞中根本行不通，部分原因是真核RNA含有内含子和外显子，必须在翻译开始前进行编辑。因此，真核细胞核在细胞内提供了一个独特的隔间，允许在翻译开始之前进行转录和拼接。因此，在真核生物中，虽然转录发生在细胞核中，但翻译发生在细胞质中。换句话说，真核转录和翻译在空间和时间上是隔离的。细胞质中的mRNA有一些其他的识别结构特征。在真核细胞中，mRNA通常是一种单顺反子消息(monocistronicmessage)，该单顺反子消息只编码一种多肽。5’端用一种特殊的结构盖住，该结构涉及7-甲基鸟苷，通过5’-三磷酸桥与信使序列的5’端相连。一个长度可能很短或数百个核苷酸5’-非翻译区将帽和翻译起始位点分开，其中含有一个AUG密码子。大多数脊椎动物mRNA的前导序列长度为20～100个核苷酸。通常翻译起始位点是第一个AUG序列，因为消息是从5’端到3’端读取的。然后，编码多肽的信息序列与启动信号相邻。多肽编码序列一直持续到达到特定的翻译终止位点，在mRNA终止于腺苷酸尾部之前，该位点后是一个长度约为100个核苷酸的3’非翻译序列。在真核生物中，起始氨基酸是蛋氨酸而不是N-甲酰基蛋氨酸。然而，与原核生物一样，一种特殊的tRNA参与启动。这个氨基乙酰-tRNA被称为Met-tRNAi或Met-tRNAf(下标“i”代表启动，“f”表示它可以在体外被甲酰化)。原核mRNA与真核mRNA在其他一些重要方面有所不同。5’末端不封端，但保留了一个由RNA聚合酶启动合成的末端三磷酸。大多数原核mRNA是多顺反子性的，编码几个多肽，并且可以包括多于一个的起始AUG序列。在每种情况下，核糖体定位序列位于AUG起始信号上游约10个核苷酸。一个未翻译的序列跟随最后一个编码序列，但没有聚腺苷酸化的3’尾巴。真核mRNA的翻译起始位点也称为Kozak序列。示例性Kozak序列的形式可以是：((gcc)gccRccAUGG。这个基序中最高度保守的位置是ATG密码子上游三个核苷酸的嘌呤(最常见的是A)，它表示翻译的开始。如上所提到，在大多数原核生物中，被称为SD(Shine-Dalgarno)序列的富含嘌呤的核糖体结合位点通过与16S核糖体RNA的富含嘧啶的区域相互作用来协助30S核糖体组分相对于mRNA上的起始密码子的结合和定位。SD序列位于mRNA的从转录开始的下游和翻译开始的上游，通常从起始密码子上游的4-14个核苷酸开始，更典型的是从起始密码子上游的8-10个核苷酸开始。SD序列一般可具有5’-AGGAGG-3’的六碱基共有序列。真核生物中的起始密码子总是AUG，而原核生物并不使用5’侧富含嘌呤的特异性序列来区分起始密码子AUG和内部密码子。相反，通常选择最接近mRNA5’端的AUG作为起始位点。40S核糖体附着在真核mRNA的5’端的帽上，并沿着3’的方向一步一步地寻找AUG密码子。真核蛋白合成中的这一扫描过程由水解ATP的解旋酶驱动。Met-tRNAi的反密码子与mRNA的AUG密码子配对，标志着目标已被发现。在几乎所有的情况下，真核mRNA只有一个起始位点，因此是单一蛋白的模板。相反，如上所述，原核mRNA可以有多个SD序列，因此，具有起始位点，它可以作为多个蛋白合成的模板。真核生物利用的启动因子比原核生物多得多，它们之间的相互作用也复杂得多。前缀elF表示真核启动因子。例如，eIF-4E是一种直接与7-甲基鸟苷帽结合的蛋白，而eIF-4A是一种解旋酶。原核生物和真核生物在启动机制上的差异，部分是由于RNA加工的不同造成的。在原核生物中，mRNA的5’端在转录后立即容易被核糖体利用。相比之下，在真核生物中，前mRNA必须在翻译开始之前被处理并转运到细胞质中。因此，有足够的机会形成复杂的二级结构，这些结构必须被去除，以暴露成熟mRNA中的信号。5’帽提供了一个易识别的起点。从以上可以看出，真核mRNA和原核mRNA的转录和翻译之间存在着许多结构性、遗传性和调节性的差异。例如，原核mRNA不能被真核80S核糖体翻译。基于这些不同之处，生成可能整合和/或稳定表达跨越这两个界的mRNA的转基因生物体的能力代表了经基因修饰的生物体领域的实际和商业限制。事实上，关于mRNA的跨界表达的上述问题可能代表了长期以来对一个有效、经济的解决方案的需求。虽然实施要素可能已经有了，但可能在某种程度上缺乏满足这一需求的实际尝试。这可能是由于具有本
普通技能的人未能充分认识或理解所涉及的问题和挑战的性质。由于缺乏了解，为满足这些长期以来的需求而进行的尝试可能已经无法有效地解决这里所确定的一个或多个问题或挑战。这些尝试甚至可能已经偏离了本专利技术技术所采取的技术方向，甚至可能导致本专利技术技术的成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种瞬态CRISPR基因组编辑的方法，包含以下步骤：/n生成经基因修饰的供体原核生物，所述经基因修饰的供体原核生物表达与编码异源Euk-mRNA的启动子可操作地连接的异源核苷酸序列，其中所述异源Euk-mRNA在所述供体原核生物中不可翻译并且进一步包括：/n至少一个形成核糖体调节控制区的非翻译区(UTR)，所述至少一个UTR被配置为促进真核核糖体聚集；/n编码区，所述编码区编码至少一种能在真核生物中翻译的CRISPR相关内切核酸酶；/n去除原核生物核糖体结合位点；/nKozak共有序列；/n聚腺苷酸化(poly-A)区域，所述Poly-A区域被配置为促进Poly-A结合蛋白；/n在所述供体原核生物中表达所述异源Euk-mRNA；/n在受体真核生物中共表达至少一种被配置为与靶基因组序列杂交的引导RNA(gRNA)；/n将所述异源Euk-mRNA和所述gRNA从所述供体原核生物运输到所述受体真核生物；以及/n在所述受体真核生物中翻译来自所述异源Euk-mRNA的所述CRISPR相关内切核酸酶，所述受体真核生物生成异源CRISPR相关内切核酸酶，所述异源CRISPR相关内切核酸酶与所述gRNA结合形成复合物，并与所述靶基因组序列结合，在所述真核生物中执行基因组编辑功能。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180704 US 62/693,9631.一种瞬态CRISPR基因组编辑的方法，包含以下步骤：
生成经基因修饰的供体原核生物，所述经基因修饰的供体原核生物表达与编码异源Euk-mRNA的启动子可操作地连接的异源核苷酸序列，其中所述异源Euk-mRNA在所述供体原核生物中不可翻译并且进一步包括：
至少一个形成核糖体调节控制区的非翻译区(UTR)，所述至少一个UTR被配置为促进真核核糖体聚集；
编码区，所述编码区编码至少一种能在真核生物中翻译的CRISPR相关内切核酸酶；
去除原核生物核糖体结合位点；
Kozak共有序列；
聚腺苷酸化(poly-A)区域，所述Poly-A区域被配置为促进Poly-A结合蛋白；
在所述供体原核生物中表达所述异源Euk-mRNA；
在受体真核生物中共表达至少一种被配置为与靶基因组序列杂交的引导RNA(gRNA)；
将所述异源Euk-mRNA和所述gRNA从所述供体原核生物运输到所述受体真核生物；以及
在所述受体真核生物中翻译来自所述异源Euk-mRNA的所述CRISPR相关内切核酸酶，所述受体真核生物生成异源CRISPR相关内切核酸酶，所述异源CRISPR相关内切核酸酶与所述gRNA结合形成复合物，并与所述靶基因组序列结合，在所述真核生物中执行基因组编辑功能。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述编码至少一种CRISPR相关内切核酸酶的编码区包含编码Cas9蛋白的编码区。


3.根据权利要求1所述的方法，其中所述编码至少一种CRISPR相关内切核酸酶的编码区包含选自由以下组成的群组中的编码CRISPR相关内切核酸酶的编码区：根据SEQID.NO.30的氨基酸序列；根据SEQID.NO.32的氨基酸序列；根据SEQID.NO.33的氨基酸序列；根据SEQID.NO.29的核苷酸序列；以及根据SEQID.NO.31的核苷酸序列。


4.根据权利要求2所述的方法，其中所述Euk-mRNA进一步包括稳定区，所述稳定区包含分别定位在所述Euk-mRNA的5’端和3’端的至少两个可杂交序列，所述至少两个可杂交序列进一步被配置为形成发夹环。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述供体原核生物包含供体菌。


6.根据权利要求5所述的方法，其中所述供体菌选自由以下组成的群组：共生供体菌；内共生供体菌；内寄生供体菌；益生菌供体菌；肠道菌；RNaseIII缺失供体菌；具有内源性超起泡活性的供体菌；具有内源性超起泡活性的供体菌；基因工程化为具有超起泡活性的供体菌；枯草芽孢杆菌菌株CCB422；大肠杆菌菌株HT27；大肠杆菌菌株HT115；大肠杆菌菌株JC8031；以及阴沟肠杆菌菌株Ae003。


7.根据权利要求4所述的方法，其中所述启动子包含诱导型启动子。


8.根据权利要求4所述的方法，进一步包含具有真核停止信号的Euk-mRNA。


9.根据权利要求4所述的方法，其中所述形成核糖体调节控制区的非翻译区(UTR)包含选自由以下组成的群组中的形成核糖体调节控制区的非翻译区(UTR)：内部核糖体进入位点(IRES)序列；和经定位的不依赖帽翻译元件”(CITE)序列。


10.根据权利要求9所述的方法，其中所述IRES序列包含选自由以下组成的群组中的IRES序列：烟草花叶病毒IRES(crTMV)；烟草蚀刻病毒IRES(TEV)；芜菁花叶马铃薯Y病毒IRES(TuMV)；烟草(Nicotianatabacum)热休克蛋白IRES(NtHSF)和人工IRES序列。


11.根据权利要求9所述的方法，其中所述IRES序列包含选自由以下组成的群组中的IRES序列：根据SEQIDNO.34至SEQIDNO.37的核苷酸序列


12.根据权利要求9所述的方法，其中所述CITE序列包含选自由以下组成的群组中的CITE序列：烟草坏死卫星病毒(SNTV)CITE；和人工CITE序列。


13.根据权利要求9所述的方法，其中所述CITE序列包含根据SEQIDNO.38的核苷酸序列。


14.根据权利要求4所述的方法，其中所述Euk-mRNA进一步包含至少一个额外的内源性3’UTR，所述至少一个额外的内源性3’UTR被配置为聚集促进真核生物核糖体相互作用的蛋白复合物。


15.根据权利要求4所述的方法，其中所述将所述异源Euk-mRNA和所述gRNA从所述供体原核生物运输到受体真核生物的步骤包含通过外膜囊泡(OMV)将所述异源Euk-mRNA和所述gRNA从所述供体原核生物运输到受体真核生物的步骤。


16.根据权利要求4所述的方法，进一步包含生成与所述Euk-mRNA和所述gRNA共表达异源核苷酸序列的经基因修饰的的供体原核生物的步骤，所述异源核苷酸序列可操作地连接到编码至少一个异源辅助基因的启动子，所述至少一个异源辅助基因编码至少一个辅助蛋白，所述至少一个辅助蛋白被配置为增加所述Euk-mRNA和所述gRNA从供体原核生物到受体真核细胞的运输效率。


17.根据权利要求16所述的方法，其中所述被配置为增加所述Euk-mRNA从供体原核生物到受体真核细胞的运输效率的至少一种辅助蛋白包含至少一种与细菌分泌信号偶联的嵌合RNA结合辅助蛋白。


18.根据权利要求17所述的方法，其中所述至少一种与细菌分泌信号偶联的嵌合RNA结合辅助蛋白选自由以下组成的群组：与OmpA细菌分泌信号偶联的dsRNA结合蛋白2(DRB4)；和与OmpA细菌分泌信号偶联的韧皮蛋白2-A1(PP2-A1)。


19.根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一种与细菌分泌信号偶联的嵌合RNA结合辅助蛋白选自由以下组成的群组：与SEQIDNO.25的氨基酸序列偶联的SEQIDNO.11的氨基酸序列；和与SEQIDNO.27的氨基酸序列偶联的SEQIDNO.11的氨基酸序列。


20.根据权利要求17所述的方法，其中所述被配置为增加所述Euk-mRNA从供体原核生物到受体真核细胞的运输效率的至少一种辅助蛋白选自由以下组成的群组：根据SEQIDNO.25的氨基酸序列；根据SEQIDNO.27的氨基酸序列；根据SEQIDNO.24的核苷酸序列；以及根据SEQIDNO.26的核苷酸序列。


21.根据权利要求17和18所述的方法，其中所述细菌分泌信号包含选自由以下组成的群组中的细菌分泌信号：来自胡萝卜软腐欧文氏菌的PelB(果胶酸裂合酶B)；OmpA(外膜蛋白A)；StII(热稳定肠毒素2)；来自芽孢杆菌的内切木聚糖酶；PhoA(碱性磷酸酶)；OmpF(外膜蛋白F)；PhoE(外膜孔蛋白E)；MalE(麦芽糖结合蛋白)；OmpC(外膜蛋白C)；Lpp(胞壁质脂蛋白)；LamB(λ受体蛋白)；OmpT(蛋白酶VII)；LTB(热不稳定肠毒素亚单位B)；以及HylA(a-溶血素)。


22.根据权利要求17所述的方法，其中所述细菌分泌信号包含选自由以下组成的群组中的细菌分泌信号：根据SEQIDNO.11至SEQIDNO.23的氨基酸序列。


23.根据权利要求4所述的方法，其中所述稳定区包含分别定位在所述Euk-mRNA的5’端和3’端的两个可杂交序列，所述两个可杂交序列进一步被配置为形成Euk-mRNA发夹环包含分别定位在所述Euk-mRNA的5’端和3’端的至少两个可杂交GC富集序列，所述至少两个可杂交GC富集序列进一步被配置为形成发夹Euk-mRNA环结构。


24.根据权利要求4所述的方法，其中所述Euk-mRNA环结构被配置为稳定Euk-mRNA分子，防止简并，提高运输效率，并且不干扰所述受体真核生物中的真核生物核糖体结合和翻译。


25.根据权利要求4所述的方法，其中所述Euk-mRNA环结构被配置为促进所述受体真核生物中的翻译。


26.一种经基因修饰的细菌，所述经基因修饰的细菌表达与编码异源Euk-mRNA的启动子可操作地连接的异源核苷酸序列，其中所述异源Euk-mRNA在所述供体原核生物中不可翻译并且进一步包括：
至少一个形成核糖体调节控制区的非翻译区(ETTR)，所述至少一个ETTR被配置为促进真核核糖体聚集；
编码区，所述编码区编码至少一种能在真核生物中翻译的CRISPR相关内切核酸酶；
去除原核生物核糖体结合位点；
Kozak共有序列；以及
聚腺苷酸化(poly-A)区域，所述poly-A区域被配置为促进Poly-A结合蛋白；
在受体真核生物中共表达至少一种被配置为与靶基因组序列杂交的引导RNA(gRNA)。


27.根据权利要求26所述的细菌，其中所述编码至少一种CRISPR相关内切核酸酶的编码区包含编码Cas9蛋白的编码区。


28.根据权利要求26所述的细菌，其中所述编码至少一种CRISPR相关内切核酸酶的编码区包含选自由以下组成的群组中的编码CRISPR相关内切核酸酶的编码区：根据SEQID.NO.30的氨基酸序列；根据SEQID.NO.32的氨基酸序列；根据SEQID.NO.33的氨基酸序列；根据SEQID.NO.29的核苷酸序列；以及根据SEQID.NO.31的核苷酸序列。


29.根据权利要求27所述的细菌，其中所述Euk-mRNA进一步包括稳定区，所述稳定区包含分别定位在所述Euk-mRNA的5’端和3’端的至少两个可杂交序列，所述至少两个可杂交序列进一步被配置为形成发夹环。


30.根据权利要求29所述的细菌，其中所述供体原核生物包含供体菌。


31.根据权利要求30所述的细菌，其中所述供体菌选自由以下组成的群组：共生供体菌；内共生供体菌；内寄生供体菌；益生菌供体菌；肠道菌；RNaseIII缺失供体菌；具有内源性超起泡活性的供体菌；具有内源性超起泡活性的供体菌；基因工程化为具有超起泡活性的供体菌；枯草芽孢杆菌菌株CCB422；大肠杆菌菌株HT27；大肠杆菌菌株HT115；大肠杆菌菌株JC8031；以及阴沟肠杆菌菌株Ae003。


32.根据权利要求29所述的细菌，其中所述启动子包含诱导型启动子。


33.根据权利要求29所述的细菌，进一步包含具有真核停止信号的Euk-mRNA。


34.根据权利要求29所述的细菌，其中所述形成核糖体调节控制区的非翻译区(UTR)包含选自由以下组成的群组中的形成核糖体调节控制区的非翻译区(UTR)：内部核糖体进入位点(IRES)序列；和经定位的不依赖帽翻译元件”(CITE)序列。


35.根据权利要求34所述的细菌，其中所述IRES序列包含选自由以下组成的群组中的IRES序列：烟草花叶病毒IRES(crTMV)；烟草蚀刻病毒IRES(TEV)；芜菁花叶马铃薯Y病毒IRES(TuMV)；烟草热休克蛋白IRES(NtHSF)和人工IRES序列。


36.根据权利要求34所述的细菌，其中所述IRES序列包含选自由以下组成的群组中的IRES序列：根据SEQIDNO.34至SEQIDNO.37的核苷酸序列。


37.根据权利要求34所述的细菌，其中所述CITE序列包含选自由以下组成的群组中的CITE序列：烟草坏死卫星病毒(SNTV)CITE；和人工CITE序列。


38.根据权利要求34所述的细菌，其中所述CITE序列包含根据SEQIDNO.38的核苷酸序列。


39.根据权利要求29所述的细菌，其中所述Euk-mRNA进一步包含至少一个额外的内源性3’UTR，所述至少一个额外的内源性3’UTR被配置为聚集促进真核生物核糖体相互作用的蛋白复合物。


40.根据权利要求29所述的细菌，其中所述将所述异源Euk-mRNA和所述gRNA从所述供体原核生物运输到受体真核生物的步骤包含通过外膜囊泡(OMV)将所述异源Euk-mRNA和所述gRNA从所述供体原核生物运输到受体真核生物的步骤。


41.根据权利要求29所述的细菌，进一步包含生成与所述Euk-mRNA和所述gRNA共表达异源核苷酸序列的经基因修饰的供体原核生物的步骤，所述异源核苷酸序列可操作地连接到编码至少一个异源辅助基因的启动子，所述至少一个异源辅助基因编码至少一个辅助蛋白，所述至少一个辅助蛋白被配置为增加所述Euk-mRNA和所述gRNA从供体原核生物到受体真核细胞的运输效率。


42.根据权利要求41所述的细菌，其中所述被配置为增加所述Euk-mRNA从供体原核生物到受体真核细胞的运输效率的至少一种辅助蛋白包含至少一种与细菌分泌信号偶联的嵌合RNA结合辅助蛋白。


43.根据权利要求42所述的细菌，其中所述至少一种与细菌分泌信号偶联的嵌合RNA结合辅助蛋白选自由以下组成的群组：与OmpA细菌分泌信号偶联的dsRNA结合蛋白2(DRB4)；和与OmpA细菌分泌信号偶联的韧皮蛋白2-A1(PP2-A1)。


44.根据权利要求43所述的细菌，其中所述至少一种与细菌分泌信号偶联的嵌合RNA结合辅助蛋白选自由以下组成的群组：与SEQIDNO.25的氨基酸序列偶联的SEQIDNO.11的氨基酸序列；和与SEQIDNO.27的氨基酸序列偶联的SEQIDNO.11的氨基酸序列。


45.根据权利要求42所述的细菌，其中所述被配置为增加所述Euk-mRNA从供体原核生物到受体真核细胞的运输效率的至少一种辅助蛋白选自由以下组成的群组：根据SEQIDNO.25的氨基酸序列；根据SEQIDNO.27的氨基酸序列；根据SEQIDNO.24的核苷酸序列；以及根据SEQIDNO.26的核苷酸序列。


46.根据权利要求42和43所述的细菌，其中所述细菌分泌信号包含选自由以下组成的群组中的细菌分泌信号：来自胡萝卜软腐欧文氏菌的PelB(果胶酸裂合酶B)；OmpA(外膜蛋白A)；StII(热稳定肠毒素2)；来自芽孢杆菌的内切木聚糖酶；PhoA(碱性磷酸酶)；OmpF(外膜蛋白F)；PhoE(外膜孔蛋白E)；MalE(麦芽糖结合蛋白)；OmpC(外膜蛋白C)；Lpp(胞壁质脂蛋白)；LamB(λ受体蛋白)；OmpT(蛋白酶VII)；LTB(热不稳定肠毒素亚单位B)；以及HylA(a-溶血素)。


47.根据权利要求42所述的细菌，其中所述细菌分泌信号包含选自由以下组成的群组中的细菌分泌信号：根据SEQIDNO.11至SEQIDNO.23的氨基酸序列。


48.根据权利要求CE110所述的细菌，其中所述稳定区包含分别定位在所述Euk-mRNA的5’端和3’端的两个可杂交序列，所述两个可杂交序列进一步被配置为形成Euk-mRNA发夹环包含分别定位在所述Euk-mRNA的5’端和3’端的至少两个可杂交GC富集序列，所述至少两个可杂交GC富集序列进一步被配置为形成发夹Euk-mRNA环结构。


49.根据权利要求29所述的细菌，其中所述Euk-mRNA环结构被配置为稳定Euk-mRNA分子，防止简并，提高运输效率，并且不干扰所述受体真核生物的真核生物核糖体结合和翻译。


50.根据权利要求29所述的细菌，其中所述Euk-mRNA环结构被配置为促进所述受体真核生物中的翻译。


51.一种瞬态CRISPR基因组编辑的方法，包含以下步骤：
生成经基因修饰的供体原核生物，所述经基因修饰的供体原核生物表达与编码异源Euk-mRNA的启动子可操作地连接的异源核苷酸序列，其中所述异源Euk-mRNA在所述供体原核生物中不可翻译并且进一步包括：
至少一个形成核糖体调节控制区的非翻译区(ETTR)，所述至少一个ETTR被配置为促进真核核糖体聚集；
编码区，所述编码区编码至少一种能在真核生物中翻译并且被配置为靶向基因组序列的基因编辑内切核酸酶；
去除原核生物核糖体结合位点；
Kozak共有序列；
聚腺苷酸化(poly-A)区域，所述Poly-A区域被配置为促进Poly-A结合蛋白；
在所述供体原核生物中表达所述异源Euk-mRNA；
将所述异源Euk-mRNA和所述gRNA从所述供体原核生物运输到所述受体真核生物；以及
在所述受体真核生物中翻译来自所述异源Euk-mRNA的所述CRISPR相关内切核酸酶，所述受体真核生物生成异源CRISPR相关内切核酸酶，所述异源CRISPR相关内切核酸酶与所述gRNA结合形成复合物，并与所述靶基因组序列结合，在所述真核生物中执行基因组编辑功能。


52.根据权利要求51所述的方法，其中所述Euk-mRNA进一步包括稳定区，所述稳定区包含分别定位在所述Euk-mRNA的5’端和3’端的至少两个可杂交序列，所述至少两个可杂交序列进一步被配置为形成发夹环。


53.根据权利要求52所述的方法，其中所述编码至少一种CRISPR相关内切核酸酶的编码区包含编码Cas9蛋白的编码区。


54.根据权利要求52所述的方法，其中所述编码至少一种CRISPR相关内切核酸酶的编码区包含选自由以下组成的群组中的编码CRISPR相关内切核酸酶的编码区：根据SEQID.NO.30的氨基酸序列；根据SEQID.NO.32的氨基酸序列；根据SEQID.NO.33的氨基酸序列；根据SEQID.NO.29的核苷酸序列；以及根据SEQID.NO.31的核苷酸序列。


55.根据权利要求53所述的方法，进一步包含在受体真核生物中共表达至少一种被配置为与所述靶基因组序列杂交的引导RNA(gRNA)的步骤。


56.根据权利要求52所述的方法，其中所述基因编辑内切核酸酶包含选自由以下组成的群组中的基因编辑内切核酸酶：CRISPR相关内切核酸酶、Cas9、Cas3、TALAN相关内切核酸酶；巨核酶；以及锌指相关内切核酸酶。


57.根据权利要求52所述的方法，其中所述供体原核生物包含供体菌。


58.根据权利要求57所述的方法，其中所述供体菌选自由以下组成的群组：共生供体菌；内共生供体菌；内寄生供体菌；益生菌供体菌；肠道菌；RNaseIII缺失供体菌；具有内源性超起泡活性的供体菌；具有内源性超起泡活性的供体菌；基因工程化为具有超起泡活性的供体菌；枯草芽孢杆菌菌株CCB422；大肠杆菌菌株HT27；大肠杆菌菌株HT115；大肠杆菌菌株JC8031；以及阴沟肠杆菌菌株Ae003。


59.根据权利要求52所述的方法，其中所述启动子包含诱导型启动子。


60.根据权利要求52所述的方法，进一步包含具有真核停止信号的Euk-mRNA。


61.根据权利要求52所述的方法，其中所述形成核糖体调节控制区的非翻译区(UTR)包含选自由以下组成的群组中的形成核糖体调节控制区的非翻译区(UTR)：内部核糖体进入位点(IRES)序列；和经定位的不依赖帽翻译元件”(CITE)序列。


62.根据权利要求61所述的方法，其中所述IRES序列包含选自由以下组成的群组中的IRES序列：烟草花叶病毒IRES(crTMV)；烟草蚀刻病毒IRES(TEV)；芜菁花叶马铃薯Y病毒IRES(TuMV)；烟草热休克蛋白IRES(NtHSF)和人工IRES序列。


63.根据权利要求61所述的方法，其中所述IRES序列包含选自由以下组成的群组中的IRES序列：根据SEQIDNO.34至SEQIDNO.37的核苷酸序列。


64.根据权利要求61所述的方法，其中所述CITE序列包含选自由以下组成的群组中的CITE序列：烟草坏死卫星病毒(SNTV)CITE；和人工CITE序列。


65.根据权利要求61所述的方法，其中所述CITE序列包含根据SEQIDNO.38的核苷酸序列。


66.根据权利要求52所述的方法，其中所述Euk-mRNA进一步包含至少一个额外的内源性3’UTR，所述至少一个额外的内源性3’UTR被配置为聚集促进真核生物核糖体相互作用的蛋白复合物。


67.根据权利要求52所述的方法，其中所述将所述异源Euk-mRNA从所述供体原核生物运输到受体真核生物的步骤包含通过外膜囊泡(OMV)将所述异源Euk-mRNA从所述供体原核生物运输到受体真核生物的步骤。


68.根据权利要求52所述的方法，进一步包含生成与所述Euk-mRNA共表达异源核苷酸序列的经基因修饰的的供体原核生物的步骤，所述异源核苷酸序列可操作地连接到编码至少一个异源辅助基因的启动子，所述至少一个异源辅助基因编码至少一个辅助蛋白，所述至少一个辅助蛋白被配置为增加所述Euk-mRNA从供体原核生物到受体真核细胞的运输效率。


69.根据权利要求68所述的方法，其中所述被配置为增加所述Euk-mRNA从供体原核生物到受体真核细胞的运输效率的至少一种辅助蛋白包含至少一种与细菌分泌信号偶联的嵌合RNA结合辅助蛋白。


70.根据权利要求69所述的方法，其中所述至少一种与细菌分泌信号偶联的嵌合RNA结合辅助蛋白选自由以下组成的群组：与OmpA细菌分泌信号偶联的dsRNA结合蛋白2(DRB4)；和与OmpA细菌分泌信号偶联的韧皮蛋白2-A1(PP2-A1)。


71.根据权利要求70所述的方法，其中所述至少一种与细菌分泌信号偶联的嵌合RNA结合辅助蛋白选自由以下组成的群组：与SEQIDNO.25的氨基酸序列偶联的SEQIDNO.11的氨基酸序列；和与SEQIDNO.27的氨基酸序列偶联的SEQIDNO.11的氨基酸序列。


72.根据权利要求69所述的方法，其中所述被配置为增加所述Euk-mRNA从供体原核生物到受体真核细胞的运输效率的至少一种辅助蛋白选自由以下组成的群组：根据SEQIDNO.25的氨基酸序列；根据SEQIDNO.27的氨基酸序列；根据SEQIDNO.24的核苷酸序列；以及根据SEQIDNO.26的核苷酸序列。


73.根据权利要求69和70所述的方法，其中所述细菌分泌信号包含选自由以下组成的群组中的细菌分泌信号：来自胡萝卜软腐欧文氏菌的PelB(果胶酸裂合酶B)；OmpA(外膜蛋白A)；StII(热稳定肠毒素2)；来自芽孢杆菌的内切木聚糖酶；PhoA(碱性磷酸酶)；OmpF(外膜蛋白F)；PhoE(外膜孔蛋白E)；MalE(麦芽糖结合蛋白)；OmpC(外膜蛋白C)；Lpp(胞壁质脂蛋白)；LamB(λ受体蛋白)；OmpT(蛋白酶VII)；LTB(热不稳定肠毒素亚单位B)；以及HylA(a-溶血素)。


74.根据权利要求69所述的方法，其中所述细菌分泌信号包含选自由以下组成的群组中的细菌分泌信号：根据SEQIDNO.11至SEQIDNO.23的氨基酸序列。


75.根据权利要求52所述的方法，其中所述稳定区包含分别定位在所述Euk-mRNA的5’端和3’端的两个可杂交序列，所述两个可杂交序列进一步被配置为形成Euk-mRNA发夹环包含分别定位在所述Euk-mRNA的5’端和3’端的至少两个可杂交GC富集序列，所述至少两个可杂交GC富集序列进一步被配置为形成发夹Euk-mRNA环结构。


76.根据权利要求75所述的方法，其中所述Euk-mRNA环结构被配置为稳定Euk-mRNA分子，防止简并，提高运输效率，并且不干扰所述受体真核生物中的真核生物核糖体结合和翻译。


77.根据权利要求76所述的方法，其中所述Euk-mRNA环结构被配置为促进所述受体真核生物中的翻译。


78.一种经基因修饰的细菌，所述经基因修饰的细菌表达与编码异源Euk-mRNA的启动子可操作地连接的异源核苷酸序列，其中所述异源Euk-mRNA在所述供体原核生物中不可翻译并且进一步包括：
至少一个形成核糖体调节控制区的非翻译区(ETTR)，所述至少一个ETTR被配置为促进真核核糖体聚集；
编码区，所述编码区编码至少一种能在真核生物中翻译并且被配置为靶向基因组序列的基因编辑内切核酸酶；
去除原核生物核糖体结合位点；
Kozak共有序列；
聚腺苷酸化(poly-A)区域，所述poly-A区域被配置为促进Poly-A结合蛋白；


79.根据权利要求78所述的细菌，其中所述Euk-mRNA进一步包括稳定区，所述稳定区包含分别定位在所述Euk-mRNA的5’端和3’端的至少两个可杂交序列，所述至少两个可杂交序列进一步被配置为形成发夹环。


80.根据权利要求78所述的方法，其中所述编码至少一种CRISPR相关内切核酸酶的编码区包含编码Cas9蛋白的编码区。


81.根据权利要求78所述的细菌，其中所述编码至少一种CRISPR相关内切核酸酶的编码区包含选自由以下组成的群组中的编码CRISPR相关内切核酸酶的编码区：根据SEQID.NO.30的氨基酸序列；根据SEQID.NO.32的氨基酸序列；根据SEQID.NO.33的氨基酸序列；根据SEQID.NO.29的核苷酸序列；以及根据SEQID.NO.31的核苷酸序列。


82.根据权利要求80所述的细菌，进一步包含在受体真核生物中共表达至少一种被配置为与所述靶基因组序列杂交的引导RNA(gRNA)的步骤。


83.根据权利要求78所述的细菌，其中所述基因编辑内切核酸酶包含选自由以下组成的群组中的基因编辑内切核酸酶：CRISPR相关内切核酸酶、Cas9、Cas3、TALAN相关内切核酸酶；巨核酶；以及锌指相关内切核酸酶。


84.根据权利要求79所述的细菌，其中所述供体原核生物包含供体菌。


85.根据权利要求84所述的细菌，其中所述供体菌选自由以下组成的群组：共生供体菌；内共生供体菌；内寄生供体菌；益生菌供体菌；肠道菌；RNaseIII缺失供体菌；具有内源性超起泡活性的供体菌；具有内源性超起泡活性的供体菌；基因工程化为具有超起泡活性的供体菌；枯草芽孢杆菌菌株CCB422；大肠杆菌菌株HT27；大肠杆菌菌株HT115；大肠杆菌菌株JC8031；以及阴沟肠杆菌菌株Ae003。


86.根据权利要求79所述的细菌，其中所述启动子包含诱导型启动子。


87.根据权利要求79所述的细菌，进一步包含具有真核停止信号的Euk-mRNA。


88.根据权利要求79所述的细菌，其中所述形成核糖体调节控制区的非翻译区(ETTR)包含选自由以下组成的群组中的形成核糖体调节控制区的非翻译区(ETTR)：内部核糖体进入位点(IRES)序列；和经定位的不依赖帽翻译元件”(CITE)序列。


89.根据权利要求88所述的细菌，其中所述IRES序列包含选自由以下组成的群组中的IRES序列：烟草花叶病毒IRES(crTMV)；烟草蚀刻病毒IRES(TEV)；芜菁花叶马铃薯Y病毒IRES(TuMV)；烟草热休克蛋白IRES(NtHSF)和人工IRES序列。


90.根据权利要求88所述的细菌，其中所述IRES序列包含选自由以下组成的群组中的IRES序列：根据SEQIDNO.34至SEQIDNO.37的核苷酸序列。


91.根据权利要求88所述的细菌，其中所述CITE序列包含选自由以下组成的群组中的CITE序列：烟草坏死卫星病毒(SNTV)CITE；和人工CITE序列。


92.根据权利要求88所述的细菌，其中所述CITE序列包含根据SEQIDNO.38的核苷酸序列。


93.根据权利要求79所述的细菌，其中所述Eu...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·塞尔，P·科斯塔努恩斯，G·H·殷，
申请(专利权)人：美国卵石实验室公司，
类型：发明
国别省市：美国;US