荧光发生核酸分子以及荧光标记靶RNA的方法技术

本发明专利技术提供一种能够在细胞内特别是哺乳类的活细胞内使mRNA可视化的荧光发生RNA以及利用该荧光发生RNA的荧光标记靶RNA的方法。本发明专利技术提供一种荧光发生核酸分子，其特征在于，包含经由接头序列连接有2个以上的荧光分子结合区的碱基序列，所述荧光分子结合区在支架序列中插入有1个以上的荧光分子结合适体序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】荧光发生核酸分子以及荧光标记靶RNA的方法
本专利技术涉及一种用于荧光标记RNA的荧光发生核酸分子(发荧光的核酸分子)、以及使用该荧光发生核酸分子的荧光标记靶RNA的方法。本申请基于2018年12月3日在日本申请的日本特愿2018-226743号主张优先权，将其内容引用至本文中。
技术介绍
为了更好地理解如何在mRNA水平控制基因表达，强烈要求建立一种使活细胞的mRNA的时空动态视觉化的方法。在标靶mRNA上添加MS2或PP713等RNA茎环的标签，并招募与荧光分子融合后的蛋白质的方法是常用于使活细胞内的mRNA可视化的方法。该技术被用于追踪细胞质内的mRNA的活动(例如，参见非专利文献1)或用于使细胞核内新生的mRNA可视化(例如，参见非专利文献2)。但是，针对添加标签后的mRNA，在使细胞内的mRNA分布的动态可视化或测定表达水平时，未结合的荧光蛋白质较高的背景经常导致难以解释结果。作为使活细胞内的mRNA视觉化的方法，可列举使用碱基序列依赖性地与特定的靶分子结合的RNA适体的方法作为候选。某种RNA适体能够通过与荧光性的低分子化合物结合来增强其荧光(例如，参见非专利文献3及4)。这样的RNA适体也被称为荧光发生RNA(fluorogenicRNA)。作为荧光发生RNA，具有例如：与GFP(Greenfluorescentprotein)的荧光团的类似物DFHBI(3,5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮)家族的低分子的荧光分子结合的Spinach或Broccoli以及它们的衍生物(例如，参见非专利文献5、专利文献1)。现有技术文献专利文献专利文献1：美国专利第9,664,676号说明书非专利文献非专利文献1：Wuetal.,Science2016,vol.352,p.1430-1435.非专利文献2：Tyagi,NatureMethods,2009,vol.6,p.331-338.非专利文献3：Paigeetal.,Science,2011,vol.333,p.642-646.非专利文献4：Filonovetal.,JournaloftheAmericanChemicalSociety,2014,vol.136,p.16299-16308.非专利文献5：Filonovetal.,CurrentProtocolsinChemicalBiology,2017,vol.8(1),p.1-28.非专利文献6：Kettereretal.,NucleicAcidsResearch,2015,vol.43,p.9564-9572.非专利文献7：Autouretal.,NucleicAcidsResearch,2016,vol.44,p.2491-2500.非专利文献8：Zouetal.,JournalofMolecularEvolution,2015,vol.81,p.172-178.非专利文献9：Ageelyetal.,ACSChemicalBiology,2016,vol.11,p.2398-2406.非专利文献10：Filonovetal.,Chemistry&Biology,2015,vol.22,p.649-660.非专利文献11：Filonovetal.,NatureBiotechnology,2011,vol.29,p.757-761.非专利文献12：Takai,etal.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2015,vol.112,p.4352-4356.非专利文献13：Zuker,NucleicAcidsResearch,2003,Vol.31,No.13,p.3406-3415.非专利文献14：Teraietal.,CellstructureandFunction,2019,Vol.44,p.153-169.非专利文献15：Algaretal.,NatureMethods,2019,Vol.16,p.815-829.非专利文献16：Jepsenetal.,NATURECOMMUNICATIONS,2018,Vol.9,Articlenumber18.非专利文献17：Hanetal.,JournaloftheAmericanChemicalSociety,2013,Vol.135,p.19033-19038.非专利文献18：Trachmanetal.,TrendsinPharmacologicalSciences,2017,vol.38(10),p.928-939.非专利文献19：GuoandBartel,Science,vol.353(6306),p.1382.
技术实现思路
专利技术想要解决的课题理论上，通过向靶mRNA添加荧光发生RNA的标签，能够使活细胞内的靶mRNA可视化并将其定量。然而，现有的荧光发生RNA均荧光强度小，未能成功使细胞内的mRNA动态视觉化。本专利技术的主要目的在于提供一种可以在细胞内、特别是哺乳类的活细胞内使mRNA可视化的荧光发生RNA以及利用该荧光发生RNA的荧光标记靶RNA的方法。用于解决课题的手段本专利技术人等经过潜心研究，结果发现通过制得将嵌入支架RNA的状态的荧光发生RNA经由接头序列多个串联连接而成的核酸分子能够显著增强与荧光分子结合时所产生的荧光的强度、通过利用该核酸分子标记靶RNA可以使活细胞内的靶RNA可视化，从而完成了本专利技术。即，本专利技术的荧光发生核酸分子、荧光标记靶RNA的方法、载体、接头序列的设计方法、荧光信号的检测方法以及抑制物质的筛选方法是下列项[1]至项[23]所述的技术方案。项1.一种荧光发生核酸分子，其特征在于，包含经由接头序列连接有2个以上的荧光分子结合区的碱基序列，所述荧光分子结合区在支架序列中插入有1个以上的荧光分子结合适体序列。项2.根据所述项1的荧光发生核酸分子，其中，所述接头序列的长度为20个碱基以上。项3.根据所述项1或项2的荧光发生核酸分子，其中，所述接头序列未形成特定的立体结构。项4.根据所述项3的荧光发生核酸分子，其中，所述荧光分子结合区在所述支架序列中插入有2个以上的所述荧光分子结合适体序列。项5.根据所述项4的荧光发生核酸分子，其中，所述荧光分子结合区通过形成含有2个以上的环结构的茎环结构的单链核酸分子中的至少2个所述环结构被取代为所述荧光分子结合适体序列的结构来构成。项6.根据所述项1至项5中任一项的荧光发生核酸分子，其中，所述荧光分子结合适体序列含有：形成以G-quadruplex结构所夹持的茎环结构的单链核酸分子的碱基序列；所述茎环结构通过4～6个碱基的茎结构和4个碱基的环结构来构成。项7.根据所述项1至项5中任一项的荧光发生核酸分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光发生核酸分子，其特征在于，包含经由接头序列连接有2个以上的荧光分子结合区的碱基序列，/n所述荧光分子结合区在支架序列中插入有1个以上的荧光分子结合适体序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181203 JP 2018-2267431.一种荧光发生核酸分子，其特征在于，包含经由接头序列连接有2个以上的荧光分子结合区的碱基序列，
所述荧光分子结合区在支架序列中插入有1个以上的荧光分子结合适体序列。


2.如权利要求1所述的荧光发生核酸分子，其中，所述接头序列的长度为20个碱基以上。


3.如权利要求1或2所述的荧光发生核酸分子，其中，所述接头序列未形成特定的立体结构。


4.如权利要求1至3中任一项所述的荧光发生核酸分子，其中，所述荧光分子结合区在所述支架序列中插入有2个以上的所述荧光分子结合适体序列。


5.如权利要求4所述的荧光发生核酸分子，其中，所述荧光分子结合区通过形成含有2个以上的环结构的茎环结构的单链核酸分子中的至少2个所述环结构被取代为所述荧光分子结合适体序列的结构来构成。


6.如权利要求1至5中任一项所述的荧光发生核酸分子，其中，所述荧光分子结合适体序列含有：形成以G-quadruplex结构所夹持的茎环结构的单链核酸分子的碱基序列；
所述茎环结构通过4～6个碱基的茎结构和4个碱基的环结构来构成。


7.如权利要求1至6中任一项所述的荧光发生核酸分子，其中，所述荧光分子结合适体序列是Broccoli、Broccoli3或dBroccoli。


8.如权利要求1至5中任一项所述的荧光发生核酸分子，其中，所述荧光分子结合区通过序列号16或17所示的碱基序列来构成。


9.如权利要求1至8中任一项所述的荧光发生核酸分子，其中，所述接头序列通过序列号18～20中任意之一所示的碱基序列来构成。


10.如权利要求1至9中任一项所述的荧光发生核酸分子，其含有4个以上的所述荧光分子结合适体序列。


11.如权利要求1至10中任一项所述的荧光发生核酸分子，其中，所述荧光分子结合适体序列所结合的荧光分子是DFHBI家族的荧光分子。


12.一种荧光标记靶RNA的方法，其是对靶RNA进行荧光标记的方法；其中，使靶RNA直接或间接地连接权利要求1至11中任一项所述的荧光发生核酸分子之后，使其与所述荧光发生核酸分子中的所述荧光分子结合适体序列所结合的荧光分子接触。


13.如权利要求12所述的荧光标记靶RNA的方法，其中，所述靶RNA是靶基因的转录产物，
向在所述靶基因的3’非翻译区内整合有编码所述荧光发生核酸分子的碱基序列的细胞内，导入所述荧光发生核酸分子中的所述荧光分子结合适体序列所结合的荧光分子，并使所述靶基因的转录产物与所述荧光分子结合。


14.一种荧光标记靶RNA的方法，其是对靶RNA进行荧光标记的方法；其中，向含有靶RNA的试样中混合：
使与所述靶RNA的一部分杂交的探针直接或间接地连接于权利要求1至11中任一项所述的荧光发生核酸分子而成的核酸分子，以及
所述核酸分子中的所述荧光分子结合适体序列所结合的荧光分子。


15.一种载体，其具有：
控制外源基因的表达的启动子；
位于所述启动子的下游并且用于插入所述外源基因的编码区的限制性酶切位点；以及
位于所述限制性酶切位点的下游的3’非翻译区，
所述3’非翻译区包含编码权利要求1至11中任一项所述的荧光发生核酸分子的碱基序列。...

【专利技术属性】
技术研发人员：冈田康志，有吉哲郎，
申请(专利权)人：国立研究开发法人科学技术振兴机构，
类型：发明
国别省市：日本;JP