经改造的Cas9蛋白及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种蛋白质，其由下述序列构成且具有与向导RNA结合的能力，所述序列包含如下氨基酸序列：在序列号2所示的氨基酸序列中，具有在第721～755位之间连续的缺失区域，与该缺失区域分别相邻的氨基酸通过由3～10个氨基酸残基构成的接头连接。该蛋白质尽管存在缺失区域、与全长的dSaCas9相比缩小，但是与向导RNA结合的能力以及DNA结合亲和性得到了维持。小型化的dSaCas9蛋白的使用使更多的基因向载体中的搭载成为可能。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经改造的Cas9蛋白及其用途
本专利技术涉及维持了与向导RNA结合的能力且小型化的经改造的Cas9蛋白及其用途。
技术介绍
已知成簇的规律性间隔的短回文重复序列(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats：CRISPR)与Cas(CRISPR相关)基因一起构成细菌及古细菌中提供对入侵外源核酸的获得性抗性的适应性免疫系统。CRISPR大多起源于噬菌体或质粒DNA，由在其间插入了尺寸相似的被称为间隔子的独特的可变DNA序列的、24～48bp的短的保守重复序列构成。另外，在重复序列及间隔子序列附近存在编码Cas蛋白家族的基因群。CRISPR/Cas系统中，外源性DNA被Cas蛋白家族切成30bp左右的片段并被插入到CRISPR中。作为Cas蛋白家族之一的Cas1及Cas2蛋白识别外源性DNA的被称为前间隔序列邻近基序(proto-spaceradjacentmotif，PAM)的碱基序列，切取其上游并插入到宿主的CRISPR序列中，其形成细菌的免疫记忆。转录包含免疫记忆的CRISPR序列而生成的RNA(称为pre-crRNA。)与部分互补的RNA(trans-activatingcrRNA：tracrRNA)配对，整合到作为Cas蛋白家族之一的Cas9蛋白中。整合到Cas9中的pre-crRNA及tracrRNA被RNaseIII切断，成为包含外源序列(向导序列)的小的RNA片段(CRISPR-RNAs：crRNAs)，形成Cas9-crRNA-tracrRNA复合物。Cas9-crRNA-tracrRNA复合物结合到与crRNA互补的外源入侵DNA上，作为切断DNA的酶(nuclease)的Cas9蛋白将外源入侵DNA切断，由此抑制和消除从外部入侵的DNA的功能。近年来，正在积极开发将CRISPR/Cas系统应用于基因组编辑的技术。使crRNA和tracrRNA融合而以tracrRNA-crRNA嵌合体(以下称为向导RNA(guideRNA：gRNA)。)形式表达，并有效利用。由此引进核酸酶(RNA-guidednuclease：RGN)并在目标位点切断基因组DNA。另一方面，通过在作为基因组编辑系统之一的CRISPR/Cas9中的Cas9蛋白的核酸酶已失活的变异体(nuclease-null，dCas9)中融合VP64、VP160等转录活化因子或KRAB等转录抑制因子等转录调控因子，从而能够形成能调节靶基因的表达水平的系统。例如，为了进一步提高基因活化的效率而与将2个转录活性因子连接而成的活化因子(VP64-Rta)、将3个转录活性因子连接而成的活化因子(VP64-p65-Rta，VPR)融合，该融合而得的dCas9蛋白(dCas9-VPR；dCas9融合蛋白)在不切断DNA的情况下强烈活化靶基因的表达。对于Cas9蛋白，以PAM特异性的缓和、核酸酶活性的改造(活化/失活)、小型化为目的，已研制并报道了各种变异体(专利文献1～3)。现有技术文献专利文献专利文献1：WO2016/141224A1专利文献2：WO2017/010543A1专利文献3：WO2018/074979A1
技术实现思路
专利技术所要解决的问题在体内的dCas9融合蛋白的表达中，需要表达载体。基因治疗中，从安全性和效率高角度来看，腺相关病毒载体(AAV)逐渐成为主流，但是AAV的可搭载的尺寸为4.4kb左右，而dCas9蛋白已占据4kb左右，搭载于AAV中时，融合蛋白的构成极其受限。因此，本专利技术人的目的在于，提供具有与全长蛋白质实质上同等的DNA结合亲和性且进一步小型化的dCas9蛋白的变异体。用于解决问题的方法本专利技术人着眼于作为Cas9蛋白的源自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的Cas9(本说明书中也称为SaCas9)的无核酸酶(nuclease-null)变异体(dSaCas9)，为了解决上述问题进行了深入研究。结果发现了即使发生缺失也较少影响与向导RNA结合的能力的特定区域，进而通过将规定位置的氨基酸置换为特定氨基酸，成功地制造出DNA结合亲和性得到了维持、甚至增强且小型化的dSaCas9蛋白，从而完成了本专利技术。将缺失及置换一并称为变异。本说明书中，有时将导入变异前的dSaCas9蛋白称为野生型dSaCas9(蛋白)、将导入变异后的dSaCas9蛋白称为dSaCas9变异体(蛋白)。即，本专利技术如下所述。[1]一种蛋白质，其由下述序列构成且具有与向导RNA结合的能力，所述序列包含如下氨基酸序列：在序列号2所示的氨基酸序列中，具有在第721～755位之间连续的缺失区域，与该缺失区域分别相邻的氨基酸通过由3～10个氨基酸残基构成的接头连接。[2]根据上述[1]所述的蛋白质，其中，接头是由甘氨酸(G)及丝氨酸(S)构成的、长度为5～9个氨基酸的接头。[3]根据上述[2]所述的蛋白质，其中，接头从以下接头中选择：-SGGGS-、-GGSGGS-、-SGSGSGSG-、-SGSGSGSGS-。[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质，其中，该缺失区域为第721～745位的区域。[5]根据上述[4]所述的蛋白质，其由序列号4表示。[6]根据上述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质，其中，该缺失区域为第721～755位的区域。[7]根据上述[6]所述的蛋白质，其由序列号6表示。[8]根据上述[1]～[7]中任一项所述的蛋白质，其中，进一步地，第45位和/或第163位的谷氨酸(E)被置换为其它氨基酸。[9]根据上述[8]所述的蛋白质，其中，其它氨基酸为碱性氨基酸。[10]根据上述[9]所述的蛋白质，其中，碱性氨基酸为赖氨酸(K)。[11]根据上述[1]～[10]中任一项所述的蛋白质，其中，在序列号2的除实施了变异和/或缺失的位置以外的部位具有80％以上的一致性。[12]根据上述[1]～[10]中任一项所述的蛋白质，其中，在序列号2的除实施了变异和/或缺失的位置以外的部位置换、缺失、插入和/或添加了1个～几个氨基酸。[13]根据上述[1]～[12]中任一项所述的蛋白质，其连接有转录调控因子蛋白或结构域。[14]根据上述[13]所述的蛋白质，其中，转录调控因子为转录活化因子。[15]根据上述[13]所述的蛋白质，其中，转录调控因子为转录沉默子或转录抑制因子。[16]一种核酸，其编码上述[1]～[15]中任一项所述的蛋白质。[17]一种蛋白质-RNA复合物，其具备上述[1]～[16]中任一项所述的蛋白质和包含下述多核苷酸的向导RNA，所述多核苷酸由与靶双链多核苷酸中的PAM(Proto-spacerAdjacentMotif，前间隔序列邻近基序)序列的上游1个碱基至上游20个碱基以上且24个碱基以下的碱基序列互补本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，其由下述序列构成且具有与向导RNA结合的能力，所述序列包含如下氨基酸序列：/n在序列号2所示的氨基酸序列中，具有在第721～755位之间连续的缺失区域，/n与该缺失区域分别相邻的氨基酸通过由3～10个氨基酸残基构成的接头连接。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181024 US 62/749,8551.一种蛋白质，其由下述序列构成且具有与向导RNA结合的能力，所述序列包含如下氨基酸序列：
在序列号2所示的氨基酸序列中，具有在第721～755位之间连续的缺失区域，
与该缺失区域分别相邻的氨基酸通过由3～10个氨基酸残基构成的接头连接。


2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中，接头是由甘氨酸(G)及丝氨酸(S)构成的长度为5～9个氨基酸的接头。


3.根据权利要求2所述的蛋白质，其中，接头从以下接头中选择：
-SGGGS-、
-GGSGGS-、
-SGSGSGSG-、
-SGSGSGSGS-。


4.根据权利要求1～3中任一项所述的蛋白质，其中，该缺失区域为第721～745位的区域。


5.根据权利要求4所述的蛋白质，其由序列号4表示。


6.根据权利要求1～3中任一项所述的蛋白质，其中，该缺失区域为第721～755位的区域。


7.根据权利要求6所述的蛋白质，其由序列号6表示。


8.根据权利要求1～7中任一项所述的蛋白质，其中，进一步地，第45位和/或第163位的谷氨酸(E)被置换为其它氨基酸。


9.根据权利要求8所述的蛋白质，其中，其它氨基酸为碱性氨基酸。


10.根据权利要求9所述的蛋白质，其中，碱性氨基酸为赖氨酸(K)。


11.根据权利要求1～10中任一项所述的蛋白质，其中，在序列号2的除实施了变异和/或缺失的位置以外的部位具有80％以上的一致性。


12.根据权利要求1～10中任一项所述的蛋白质，其中，在序列号2的除实施了变异和/或缺失的位置以外的部位置换、缺失、插入和/或添加了1个～几...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦园博，
申请(专利权)人：摩大力斯医疗株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP