用于治疗癌症的新型免疫细胞因子制造技术

本发明专利技术涉及可用于治疗癌症的新型免疫细胞因子。这些融合蛋白包含(i)抗体或其抗原结合片段，与(ii)可裂解肽连接子及(iii)细胞因子或其功能片段融合。同时公开了使用所述免疫细胞因子的治疗方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗癌症的新型免疫细胞因子
本专利技术涉及新型免疫细胞因子及其在治疗癌症中的用途。
技术介绍
尽管针对各种类型的血液系统恶性肿瘤和一些实体瘤(例如转移性睾丸癌)的治疗已经取得成功，但是大多数播散性实体癌症仍然无法治愈。常规癌症治疗方法的治疗功效通常受到有机小分子无法在疾病部位累积足够的量的限制(例如参见vanderVeldtAA等人，ClinCancerRes.19：4163–4173,2013)。现在开发了新的策略，其优先激活相关的免疫亚群，例如效应T细胞、单核细胞和NK细胞，同时限制调节性T细胞的激活。但是，显著的副作用和不利的药代动力学特性已经成为阻碍治疗相关剂量施用的主要缺点。尤其是，细胞因子免疫疗法通常会导致产生严重的剂量限制副作用(Pachella等人，PractOncol6：212–221,2015)。大多数细胞因子共有的两个特性被认为在与治疗相关的不良反应的发生中起着至关重要的作用。首先，细胞因子具有多效性，意味着其可以影响多于一种的细胞类型。此外，细胞因子具有短的血清半衰期，因此需要以高剂量施用以达到其治疗效果。在有效提高治疗功效的同时，高剂量会加剧多效活性，在患者中显现为不良反应。一种旨在提高功效的方法试图通过将细胞因子遗传融合到抗体或抗体成分(例如单链可变片段(scFv))上，以将细胞因子递送到肿瘤部位。这样的融合蛋白称为免疫细胞因子，结合了抗体的结合特异性与细胞因子(例如IL-2)的效力(Sondel与Gillies,Antibodies1：149-171,2012；Skrombolas与Frelinger,ExpertRevClinImmunol.10(2)：207–217,2014；Kiefer与Neri,ImmunolRev.270(1)：178–192,2016)。通过使用免疫细胞因子改善了细胞因子向肿瘤部位的递送，尤其是对于具有易于接近的肿瘤的癌症。在另一个例子中，免疫细胞因子包含细胞因子(IL-12)，其通过MMP9裂解位点与特异性抑制性抗IL-12scFv连接(Skrombolas等人,JInterferonCytokineRes.39(4)：233-245,2019)。但是，播散性全身性疾病的治疗可能受益于针对肿瘤靶向和在肿瘤部位的激活而优化的免疫细胞因子(Sondel和Gillies,Antibodies1：149-171,2012)。特别地，抗体在肿瘤之外的结合可能导致不需要的细胞因子活性和潜在的副作用。由于已经报道某些有效载荷完全消除了癌症小鼠模型中亲本抗体的肿瘤靶向潜力，因此这个问题变得更加关键(参见例如Hess,博士学位论文,ETHZürich,2015)。因此，仍然需要一种免疫细胞因子，其能够安全有效地将细胞因子递送至肿瘤部位并激活细胞因子。附图说明图1：用于产生免疫细胞因子(ICC)的融合位点。图2：去糖基化RP-LC分离后获得的c9G4PVGLIG-IL15的去卷积MS质谱图。图3：去糖基化、IdEs消化和RP-LC分离后获得的Fc/2cG4PVGLIG-IL15的去卷积MS质谱图。图4：与mAb重链C-末端融合时，MMP-9/2连接子的可裂解性评估。报道为不能被MMP-9/2裂解的GIVGPL连接子被用作裂解特异性的阴性对照。图5：与mAb重链N-末端融合时，MMP-9/2连接子的可裂解性评估。报道为不能被MMP-9/2裂解的GIVGPL连接子被用作裂解特异性的阴性对照。HC：重链，LC：轻链，Ck：细胞因子。图6：通过人和鼠MMP-9和MMP-2(HCC-末端融合，PVGLIG连接子)评估基于c9G4的免疫细胞因子以及H16/L16-IL15和HHS76-IL15免疫细胞因子的可裂解性。(A)c9G4-Il15、H16/L16-IL15及HHS76-IL15；(B)c9G4-CCL4及c9G4-IFNa。HC：重链，LC：轻链，Ck：细胞因子。融合蛋白被用作裂解效率的阳性对照。注1：高水平的蛋白质糖基化削弱了IL15和IFNa裂解后的可视化。裂解前样品的去糖基化使得释放的细胞因子可视化，表明该蛋白未被MMP-9/2水解(数据未显示)。注3：IL15融合蛋白观察到的部分裂解可能是由于测试样品的异质性(通过尺寸排阻色谱法测得的单体含量≈50％，数据未显示)。图7：MMP-9/2连接子可裂解性评估的总结。图8：PVGLIG和GIVGPL连接子在存在MMP-9活性时，在缓冲液(50mMTrispH7.5、150mMNaCl、20mMCaCl2)中的稳定性：免疫沉淀、还原和反相分离后获得的抗(A)和抗(B)抗体的LC/MS片段谱。图9：小鼠血清中ICC裂解的分析：免疫沉淀，还原和反相分离后获得的抗片段的LC/MS谱，在T0(A)和T24(B)处没有MMP-9尖峰，在T0(C)和T24(D)处具有MMP-9尖峰。图10：IL15诱导IL2Rβ和IL2Rγ受体亚基的二聚化。来自三个独立实验的代表性数据。图11：血浆样品(RENCA移植小鼠)的蛋白质印迹分析。图12：血浆样品蛋白质印迹的光密度分析。X表示该样品缺失。图13：循环ICC(血浆样品)(RENCA移植小鼠)的统计分析。图14：肿瘤样品(RENCA移植小鼠)的蛋白质印迹分析。图15：肿瘤样品蛋白质印迹的光密度分析。X表示该样品缺失。图16：寻址至(addressedto)RENCA肿瘤的ICC的统计分析。图17：RENCA移植小鼠血浆与肿瘤中ICC-PVGLIG表现的统计分析。图18：去糖基化RP-LC分离后获得的NHS67-PVGLIG-IL15的去卷积MS质谱图。图19：去糖基化、IdEs消化和RP-LC分离后获得的Fc/2NHS67-PVGLIG-IL15的去卷积MS质谱图。图20：去糖基化RP-LC分离后获得的H16L16-PVGLIG-IL15的去卷积MS质谱图。图21：去糖基化、IdEs消化和RP-LC分离后获得的Fc/2H16L16-PVGLIG-IL15的去卷积MS质谱图。图22：纯化的c9G4-PVGLIG-hIL15、NHS76-PVGLIG-hIL15和H16L16-PVGLIG-hIL15ICC在非还原/加热(NRH)和还原/加热(RH)条件下的SDS-PAGE分析。图23：小鼠T细胞的ICC激活与对照相比。在裂解和未裂解的NHS76-PVGLIG-IL15或对照存在时，通过T细胞CD69(A)或CD25(B)表达情况，以及在裂解和未裂解的H16L16-PVGLIG-IL15或对照存在时，通过T细胞CD69(C)或CD25(D)表达情况，来测量激活情况。图24：人T细胞的ICC激活与对照相比。在裂解和未裂解的NHS76-PVGLIG-IL15或对照存在时，通过T细胞CD69(A)或CD25(B)表达情况，以及在裂解和未裂解的H16L16-PVGLIG-IL15或对照存在时，通过T细胞CD69本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.融合蛋白，其包含：/n(i)抗体或其抗原结合片段，其融合至：/n(ii)可裂解肽连接子，及/n(iii)细胞因子或其功能片段。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20190319 EP 19305336.0;20180928 US 62/738,3911.融合蛋白，其包含：
(i)抗体或其抗原结合片段，其融合至：
(ii)可裂解肽连接子，及
(iii)细胞因子或其功能片段。


2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述细胞因子为IL-15、CXCL10、IL-36或IFN-α。


3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中，所述可裂解肽连接子包含蛋白酶裂解位点。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中，所述蛋白酶裂解位点被基质金属蛋白酶或uPA裂解。


5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中，所述基质金属蛋白酶为MMP-2、MMP-9。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的融合蛋白，其中，所述可裂解肽连接子具有选自以下的序列：GPLGIAGQ、GPLGLWAQ、GPLGMLSQ、PLGLAG、PVGLIG、SGRS、SGRSA、及PSSRRRVN。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白，其中，所述抗体或其抗原结合片段选自多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、scFv、单结构域抗体(例如鲨鱼和骆驼抗体)、巨抗体、微抗体、内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和bis-scFv。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白，其中，所述细胞因子为鼠或人细胞因子，优选人细胞因子或其功能片段。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白，其中：
(i...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·罗威，JF·哈尔威，A·孔泰，C·伯特奥特，B·阿克拉，MC·贾宁比萨，
申请(专利权)人：皮埃尔法布雷医药公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR