一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法和胶体金试纸条技术

本发明专利技术公开了一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法和胶体金试纸条，本申请基于Cas12a的基因编辑，Cas12a能够在引物带领下特异性地识别新冠病毒N基因和ORF基因上的结合位点，随后Cas12a被激活，可以非特异性的剪切标记有荧光基团和猝灭基团的探针序列，切断后的探针可发出荧光，可以直接用qPCR检测新冠病毒，也可以用普通PCR扩增后，采用本申请设计的胶体金试纸条检测，本申请将基因编辑以及免疫层析技术试纸条技术结合起来，可快速完成对新冠病毒核酸的特异性检测，大大提高新冠病毒核酸检测的灵敏度和效率。

【技术实现步骤摘要】
一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法和胶体金试纸条
本专利技术涉及病毒检测
，具体涉及一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法和胶体金试纸条。
技术介绍
为了应对新型冠状病毒(COVID-19)，迅速出现了多种新冠病毒检测方法，主要分为抗体检测，抗原检测，核酸检测等，由于新冠IgM/IgG抗体出现相对滞后，不利于及时发现感染，而抗原检测的检出率偏低，不能满足临床需要，因此临床确诊主要采用核酸检测法。目前新冠病毒核酸检测的方法主要有荧光定量PCR，可以将微量的核酸序列放大到能够被仪器检测到的水平，检测灵敏度高，能够检测处于潜伏期的病原体，该方法获批的检测试剂生产厂家很多,产能也满足实际需求，但该方法需要BSL-2级实验室、实时荧光定量PCR仪和核酸提取仪等苛刻条件和昂贵设备，且检测周期较长(3-4小时)，试剂耗材成本高。等温扩增技术是近年来新出现的一种简易核酸扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同温度下具有活性的酶和特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。与PCR相比，等温扩增对仪器的要求大大简化甚至不需要仪器，反应时间也大大缩短，能更好满足快速简便检测的需求，常用的等温扩增法有环介导恒温扩增法(LAMP)，重组酶介导恒温扩增法(RAA)，和重组酶聚合酶扩增法(RPA)等，在恒定温度也能高效扩增核酸，摆脱了热循环仪的限制，但是容易产生假阳性信号。
技术实现思路
针对上述技术背景中的问题，本专利技术目的是提供一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法与胶体金试纸条。为了实现以上目的，本专利技术采用的技术方案为：一种检测新冠病毒的胶体金试纸条，该层析试纸条包括底板，在所述底板上自左至右依次分布有样品垫、金标垫、层析垫和吸收垫；所述层析垫内含有FAM单抗，所述层析垫包括粘贴在所述底板的硝酸纤维素膜、检测线与质控线，所述质控线平行排布于检测线的左侧，所述质控内抗体为易包被的大分子生物素单抗，所述检测线内抗体为羊抗鼠IgG。进一步地，所述底板的材料为PVC或PS；所述样品垫的材料为玻璃纤维素膜，其长度为15～20mm；所述金标垫的材料为聚酯纤维素膜，其长度为5～8mm；所述层析垫长度为25～30mm；所述吸收垫的材料为吸水纸，其长度为15～20mm。进一步地，所述金标垫、吸收垫分别与层析垫两端边缘上下交叠，边缘上下交叠部分中金标垫、吸收垫位于层析垫上方；所述金标垫与层析垫重叠1mm-1.5mm；所述吸收垫与层析垫重叠2mm。进一步地，所述样品垫与金标垫边缘上下交叠，边缘上下交叠部分中金标垫位于样品垫与底板之间。本专利技术的另一目的，使用上述胶体金试纸条进行新冠病毒检测的方法，包括如下步骤：1)N和ORF基因目标片段扩增采用人工合成的含有新冠病毒N基因和ORF基因序列的质粒，取2*P6High-fidelitypremix试剂盒，在引物带领下，使用PCR仪对测试基因N和ORF目标片段进行扩增；2)crRNA转录模板退火根据Cas12a识别富含T的特性，针对靶标N和ORFDNA序列，设计一段在PAM序列后的20-23bp的靶点序列；利用T7启动子(TAATACGACTCACTATAGG)+AsCas12a的scaffold序列(TAATTTCTACTCTTGTAGAT)+靶点序列(靶标DNAPAM序列后的20-23bp)构成crRNA-F，反向互补为crRNA-R，合成靶向N基因和ORF基因的crRNA-F/R两条寡核苷酸链，退火合成双链DNA；3)体外转录crRNA将crRNA-F/R退火合成双链DNA，体外转录并纯化获得N-crRNA、ORF-crRNA；4)构建新冠病毒检测体系取体外转录并纯化的N-crRNA和ORF-crRNA，N和ORF稀释成1nM和10nM，与AsCas12a250nM、ssDNA-FQ500nM、crRNA500nM置于缓冲液中；5)检测分析对测试基因N和ORF进行检测：将步骤4构建的新冠病毒检测体系，加入到去RNase的PCR中，CRISPR产物用PBS或者纯水稀释到80μl，滴加到胶体金试纸条的样品垫上，等待5-10min，观察并分析检测结果。进一步地，步骤1中N和ORF基因目标片段扩增引物名称与引物序列为：N-target-PF-2：AAGGCCAACAACAACAAGGCN-target-PR-2：TTTAGGCTCTGTTGGTGGGAORF-target-PF-2：ATCCTTTGGTGGTGCATCGTORF-target-PR-2：TTTAGCAAAACCAGCTACT。进一步地，步骤2中退火合成双链DNA方法：在PCR反应管中加入AnnealingBufferforDNAoligos(5×)20ul，DNAoligoA20ul，DNAoligoB20ul，DEPC水40ul，根据AnnealingbuffeforDNAOligos说明书的退火程序合成双链DNA。进一步地，步骤3中体外转录crRNA方法：根据测量的DNA浓度，将退火合成的DNA加入1μg所需的体积，按照T7外转录试剂盒流程进行体外转录。进一步地，对测试基因N和ORF进行检测的另一方法：将步骤4构建的新冠病毒检测体系，加入到去RNase的PCR中，qPCR仪中37℃，1h，根据荧光分析新冠病毒检测结果。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本申请基于Cas12a的基因编辑，Cas12a能够在引物带领下特异性地识别新冠病毒N基因和ORF基因上的结合位点，随后Cas12a被激活，可以非特异性的剪切标记有荧光基团和猝灭基团的探针序列，切断后的探针可发出荧光，可以直接用qPCR检测新冠病毒，也可以用普通PCR扩增后，采用本申请设计的胶体金试纸条检测，本申请将基因编辑以及免疫层析技术试纸条技术结合起来，可快速完成对新冠病毒核酸的特异性检测，大大提高新冠病毒核酸检测的灵敏度和效率。本专利技术胶体金试纸条中将质控线(C线)抗体更换为易包被的大分子生物素单抗，而且为了减少样本在等温扩增过程中产生的假阳性信号，创造性地将质控线(C线)和检测线(T线)位置互换，可以先让C线捕获样品中的未被切断探针而显色，然后让被切断的探针随着流动相继续向前流动，金标FAM可被T线捕获而显色，最终可根据显色结果对待测样本进行判读。结果判读原理：若待测样本中含有新冠病毒，经过基因编辑体系的扩增，其中的ssDNA-FQ就会被切断，当待测样本流经金标垫，未被切断的探针中的FAM端就会和金标垫中胶体金标记的FAM单抗结合形成抗原抗体复合物，通过毛细作用继续向前层析，结合物的生物素一端就会与C线上固定的生物素单抗结合，形成新的抗原抗体复合物被固定在控制线上，形成肉眼可见的红色，而被切断的探针也会在流经金标垫时和和金标垫中胶体金标记的FAM单抗结合形成抗原抗体复合物，继续向前层析与固定在T线的羊抗鼠IgG结合，形成肉眼可见的红色。附图说本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测新冠病毒的胶体金试纸条，该层析试纸条包括底板(1)，在所述底板(1)上自左至右依次分布有样品垫(2)、金标垫(3)、层析垫(4)和吸收垫(5)；其特征在于，所述层析垫(4)内含有FAM单抗，所述层析垫(4)包括粘贴在所述底板(1)的硝酸纤维素膜(6)、检测线(7)与质控线(8)，所述质控线(8)平行排布于检测线(7)的左侧，所述质控线(8)内抗体为易包被的大分子生物素单抗，所述检测线(7)内抗体为羊抗鼠IgG。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测新冠病毒的胶体金试纸条，该层析试纸条包括底板(1)，在所述底板(1)上自左至右依次分布有样品垫(2)、金标垫(3)、层析垫(4)和吸收垫(5)；其特征在于，所述层析垫(4)内含有FAM单抗，所述层析垫(4)包括粘贴在所述底板(1)的硝酸纤维素膜(6)、检测线(7)与质控线(8)，所述质控线(8)平行排布于检测线(7)的左侧，所述质控线(8)内抗体为易包被的大分子生物素单抗，所述检测线(7)内抗体为羊抗鼠IgG。


2.根据权利要求1所述的一种检测新冠病毒的胶体金试纸条，其特征在于，所述底板(1)的材料为PVC或PS；所述样品垫(2)的材料为玻璃纤维素膜，其长度为15～20mm；所述金标垫(3)的材料为聚酯纤维素膜，其长度为5～8mm；所述层析垫(4)长度为25～30mm；所述吸收垫(5)的材料为吸水纸，其长度为15～20mm。


3.根据权利要求1所述的一种检测新冠病毒的胶体金试纸条，其特征在于，所述金标垫(3)、吸收垫(5)分别与层析垫(4)两端边缘上下交叠，边缘上下交叠部分中金标垫(3)、吸收垫(5)位于层析垫(4)上方；所述金标垫(3)与层析垫(4)重叠1mm-1.5mm；所述吸收垫(5)与层析垫(4)重叠2mm。


4.根据权利要求1所述的一种检测新冠病毒的胶体金试纸条，其特征在于，所述样品垫(2)与金标垫(3)边缘上下交叠，边缘上下交叠部分中金标垫(3)位于样品垫(2)与底板(1)之间。


5.一种使用如权利要求1-4任一所述的胶体金试纸条进行新冠病毒检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)N和ORF基因目标片段扩增
采用人工合成的含有新冠病毒N基因和ORF基因序列的质粒，取2*P6High-fidelitypremix试剂盒，在引物带领下，使用PCR仪对测试基因N和ORF目标片段进行扩增；
2)crRNA转录模板退火
根据Cas12a识别富含T的特性，针对靶标N和ORFDNA序列，设计一段在PAM序列后的20-23bp的靶点序列；
利用T7启动子(TAATACGACTCACTATAGG)+AsCas12a的scaffold序列(TAATTTCTACTCTTGTAGAT)+靶点序列(靶标DNAPAM序列后的20-23bp)构成crRNA-F，反向互补为c...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵大海，叶静，沈兵，许小锋，
申请(专利权)人：安徽医科大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：安徽;34