一种羰基类代谢物的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法技术

本发明专利技术涉及一种羰基类代谢物的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法，其中，羰基类代谢物的衍生化方法包括：步骤1：待检测样品采用第一溶剂进行羰基类代谢物提取，之后进行干燥除掉第一溶剂，得到干燥样本；步骤2：将所述干燥样本溶解，加入pH调节试剂调节pH，之后加入丹磺酰肼，混合均匀后加热进行孵育，之后降温以终止反应，干燥处理得到固体，所述固体复溶，获得衍生化样本。非靶向代谢组学高效分析方法采用上述衍生化方法同步进行

【技术实现步骤摘要】
一种羰基类代谢物的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法
本专利技术涉及代谢组学分析技术，尤其是一种羰基类代谢物的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法。
技术介绍
代谢组学作为系统生物学的重要组成部分，在临床医学领域具有广泛的应用前景。代谢组学分析技术包括：NMR、GC-MS、CE-MS、LC-MS，这些技术虽然在一定程度上都能检测出代谢物，但是仍然存在诸多困难，如代谢物离子化效率低、质谱信号弱、定量缺少同位素内标、检测到的代谢物数量少、干扰多等问题。例如，LC-MS采用液相色谱-质谱联用的方法进行分析，比较不同样本中各自的代谢产物以确定其中所有的代谢产物。从本质上来说，代谢指纹分析涉及比较不同个体中代谢产物的质谱峰，最终了解不同化合物的结构，建立一套完备的识别这些不同化合物特征的分析方法。对于代谢产物来说，不仅只有质谱峰这个特征。而且，质谱(MS)并不能检测出所有的代谢产物，并不是因为质谱的灵敏度不够，而是由于质谱只能检测离子化的物质，但有些代谢产物在质谱仪中不能被离子化，因此出现测不准问题。为了解决上述问题，现有技术中有采用靶向代谢组学技术，对特定目标进行分析。靶向代谢组学是指：针对几种目标化合物或某条通路上涉及的全部或部分代谢物，利用标准品，构建特异性强、灵敏度高、重复性好的检测方法，对目标化合物进行定量与分析。靶向代谢组学只重点研究已知可能具有生物学效应的几种或几类代谢物，因此其数据处理相比于非靶向代谢组学更为简单方便。例如，专利申请CN107085032A公开了一种化学衍生化基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)的分析方法，包括以下步骤：(1)小分子化合物：以二醛类化合物为连接臂，通过缩合反应修饰至氨基化合物上，使药物代谢产物结构衍生出醛基基团。(2)多肽衍生化小分子化合物：将醛类化合物、多肽以摩尔比50-100:1加入到pH为4-6的磷酸缓冲液中，在5-37℃下发生缩合反应，多肽的氨基酸序列N端半胱氨酸修饰，作为醛类化合物衍生化试剂。(3)MALDI-TOF-MS分析：样品衍生化按照1μL样品混合基质α-氰基-4-羟基肉桂酸CHCA点板，室温风干后进行基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱，采用正离子反射模式。该方法使用二醛类化合物对含有氨基结构药物代谢物进行修饰，仅限于药物中的氨基代谢物的情况，虽然有同位素内标，但是不是为所有检测到的代谢物提供相应的同位素内标，因此仍然存在不准确问题。相对的，非靶向代谢组学是指采用LC-MS、GC-MS、NMR等技术，无偏向性的检测细胞、组织、器官或者生物体内受到刺激或扰动前后所有小分子代谢物(主要是相对分子量1000Da以内的内源性小分子化合物)的动态变化，并通过生信分析筛选差异代谢物，对差异代谢物进行通路分析，揭示其变化的生理机制。由于非靶向代谢组学没有确定的靶向，因此，原始数据的差异性大，且数据量大，如何从其中获得理想的分析结果，是非靶向代谢组学所要解决的问题之一。羰基类代谢物一般存在于绝大多数生物样本中，例如各类动物体液(血液、尿液、脑脊液等)、动植物组织样本、细胞等。中国专利技术专利申请CN112125827A公开了一种用于含羰基甾体化合物衍生化试剂的合成方法，先利用1,3-二溴丙烷和N-羟基邻苯二甲酰亚胺反应合成2-(3-溴丙氧基)异吲哚啉-1,3-二酮；再利用2-(3-溴丙氧基)异吲哚啉-1,3-二酮制备3-((1,3-二氧代-2-异吲哚啉基)-氧基)-N,N,N-三甲基丙基溴化铵；最后对3-((1,3-二氧代-2-异吲哚啉基)-氧基)-N,N,N-三甲基丙基溴化铵进行肼解，该方法检测的灵敏度有待提高。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有的代谢组学技术存在的问题，提供一种羰基类代谢物的衍生化方法，可以对含有羰基的一类代谢物进行衍生化标记，从而便于后续的液质分析进行代谢物的识别。该方法可检测的样本类型种类丰富，如血浆、血清、组织、细胞、尿液、毛发等，几乎覆盖全品类待检样品，因此运用对象广。本专利技术中，羰基类代谢物的衍生化方法包括步骤1，主要是将代谢物从样本中使用第一溶剂进行提取，第一溶剂可能是水、甲醇等；再将含有代谢物的溶剂干燥。提取的方法包括了血浆样本分析中的蛋白沉淀，组织匀浆处理等。对羰基类代谢物进行干燥，目的是除去第一溶剂干扰，得到没有第一溶剂的干燥样本。对于蛋白质含量较高的样品，例如血浆或血清、组织应先进行蛋白质沉淀，取上清液进行干燥获得干燥样本。对于蛋白质含量低的样本，例如尿液、细胞，可以省去蛋白质沉淀。对于尿液，若存在浑浊，则可以增加过滤操作，例如：将尿液样品在3-5℃、离心力>15000g的条件下离心10-20分钟，离心后取上清液，将获得的上清液采用0.2-0.3μm过滤器进行过滤，过滤后，取滤液用真空离心浓缩仪将获得的滤液完全干燥，直到产物中无溶剂时即停止干燥。需要说明的是，本专利技术步骤1奠定了后续步骤的基础，通过步骤1除去了各类代谢物中溶剂的干扰，降低了代谢物中蛋白质类干扰，确立了以可溶性代谢物作为衍生化及检测的方向。本专利技术中，羰基类代谢物的衍生化方法包括步骤2，为衍生化处理，利用标记试剂与代谢物反应，获得衍生化样本。其中，反应原理如下：上式中R1、R2代表任意化学基团。其中，丹磺酰肼的作用在于作为反应标记试剂与代谢物衍生，生成衍生化后代谢物。首先加入pH调节试剂，调节pH＝2.0。如果不进行pH调节，反应活性弱，标记反应无法完成。pH调节试剂优选盐酸，盐酸优势在于易挥发，后续可通过干燥方式简易除去，从而不影响质谱检测，并保护液相色谱柱。丹磺酰肼标记反应之后，采用物理降温淬灭反应，优点是不引入干扰。专利技术人认为，丹磺酰肼标记更适合于液相色谱-质谱分析，原因是丹磺酰肼中的芳香环结构，可显著提升衍生化后代谢物的疏水性，更适合于反向色谱分析；丹磺酰肼中的-N(CH3)2结构可显著提升衍生化后代谢物在质谱正离子模式下的检测灵敏度；同时，可在甲基处引入同位素原子13C，作为同位素内标，提升质谱定量表现。本专利技术还提供一种基于上述衍生化处理的非靶向代谢组学高效分析方法，该方法通过12C标记+13C标记，为所有羰基类代谢物提供同位素内标，检测到的代谢物以峰对的形式呈现，而杂质干扰为单独的峰，便于识别，大大提高定量的准确性，可检测到几千至上万种的代谢物，使得检测结果更可靠。具体方案如下：一种羰基类代谢物的衍生化方法，包括以下步骤：步骤1：待检测样品采用第一溶剂进行羰基类代谢物提取，之后进行干燥除掉第一溶剂，得到干燥样本；步骤2：将所述干燥样本与第二溶剂混合，使所述干燥样本溶解，加入pH调节试剂调节pH，之后加入丹磺酰肼，混合均匀后加热进行孵育，之后降温以终止反应，干燥处理得到固体，所述固体加入所述第二溶剂进行复溶，获得衍生化样本。进一步的，步骤1中，将待检测样品进行蛋白质沉淀处理后，进行离心处理取上清液，对所述上清液进行干燥，得到所述干燥样本；任选的，所述第一溶剂为甲醇、水或者甲醇水溶液；任本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种羰基类代谢物的衍生化方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤1：待检测样品采用第一溶剂进行羰基类代谢物提取，之后进行干燥除掉第一溶剂，得到干燥样本；/n步骤2：将所述干燥样本与第二溶剂混合，使所述干燥样本溶解，加入pH调节试剂调节pH，之后加入丹磺酰肼，其中，丹磺酰肼为标记试剂，混合均匀后加热进行孵育，之后降温以终止反应，干燥处理得到固体，所述固体加入所述第二溶剂进行复溶，获得衍生化样本。/n

【技术特征摘要】
1.一种羰基类代谢物的衍生化方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：待检测样品采用第一溶剂进行羰基类代谢物提取，之后进行干燥除掉第一溶剂，得到干燥样本；
步骤2：将所述干燥样本与第二溶剂混合，使所述干燥样本溶解，加入pH调节试剂调节pH，之后加入丹磺酰肼，其中，丹磺酰肼为标记试剂，混合均匀后加热进行孵育，之后降温以终止反应，干燥处理得到固体，所述固体加入所述第二溶剂进行复溶，获得衍生化样本。


2.根据权利要求1所述羰基类代谢物的衍生化方法，其特征在于：步骤1中，将待检测样品进行蛋白质沉淀处理后，进行离心处理取上清液，对所述上清液进行干燥，得到所述干燥样本；
任选的，所述第一溶剂为甲醇、水或者甲醇水溶液；
任选的，所述第二溶剂为所述衍生化样本进行液相色谱分离的洗脱剂，优选为水或者乙腈水溶液。


3.根据权利要求2所述羰基类代谢物的衍生化方法，其特征在于：步骤1中，所述待检测样品为血浆或血清样品，在3-5℃、离心力>15000g的条件下离心10-20分钟，离心后取上清液，加入甲醇，进行涡旋处理，使蛋白完全沉淀，然后进行离心，取上清液，用真空离心浓缩仪将获得的上清液完全干燥，直到产物中无溶剂时即停止干燥，得到所述干燥样本；
任选的，所述待检测样品为尿液样品，在3-5℃、离心力>15000g的条件下离心10-20分钟，离心后取上清液；用真空离心浓缩仪将获得的上清液完全干燥，直到产物中无溶剂时即停止干燥，得到所述干燥样本；
任选的，所述待检测样品为组织样品，将组织样品与甲醇混合，进行匀浆处理，之后置于-20℃孵育10-15分钟；孵育结束后，在3-5℃、离心力>15000g的条件下离心10-20分钟，离心后取上清液；用真空离心浓缩仪将获得的上清液完全干燥，直到产物中无溶剂时即停止干燥，得到所述干燥样本；
任选的，所述待检测样品为细胞样品，最少需要106个细胞，将所述细胞样品进行细胞裂解处理，得到的裂解液在3-5℃、离心力>15000g的条件下离心10...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵爽，
申请(专利权)人：厦门市迈理奥科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35