一种快速检测氨基葡萄糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测氨基葡萄糖的方法。本发明专利技术的方法包括配制N‑乙酰氨基葡萄糖溶液，在溶液中加入没食子蓝，得到没食子蓝检测试剂；向含有氨基葡萄糖生产菌株的发酵液中加入没食子蓝检测试剂，培养后检测荧光强度，根据荧光强度降低判断氨基葡萄糖含量。本发明专利技术快速检测氨基葡萄糖的方法，主要应用于测量发酵液中，可将底物N‑乙酰氨基葡萄糖转化为氨基葡萄糖的己丁二糖脱乙酰酶的总催化活性。与现有的邻苯二甲醛检测方法不同，本发明专利技术的检测方法仅需一步添加试剂混合操作，培养后即可由酶标仪进行检测。相较于现有方法，本方法简单高效，可以明显提升实验效率。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测氨基葡萄糖的方法
本专利技术涉及一种快速检测氨基葡萄糖的方法，属于生物检测

技术介绍
氨基葡萄糖是一种广泛存在于自然界的小分子单糖，在医药和保健品等领域有广泛的应用。目前，工业上生产氨基葡萄糖主要采用化学水解法，此方法以虾蟹壳中的甲壳素为底物，使用强酸进行水解，反应条件苛刻、易造成环境污染且生产效率有限。随着绿色化学、环保制造的提倡，更多的研究开始关注绿色环保的微生物发酵技术，并以甲壳素、葡萄糖等廉价产品为底物，通过水解或合成等方式生产氨基葡萄糖。其中，己丁二糖脱乙酰酶可以将相对廉价的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰水解，得到氨基葡萄糖。为了提高氨基葡萄糖的产量，需要对表达己丁二糖脱乙酰酶重组菌株进行工程改造以提高酶表达量；同时，也可以对酶本身进行定向进化提升其催化活性。然而，不论是哪一种改造方式，都需要一种可以快速对产物氨基葡萄糖的检测方法，以提升改造的实验效率。目前，对氨基葡萄糖的检测主要使用邻苯二甲醛检测试剂。其配置方法为：称取邻苯二甲醛50mg，加入到100mL，pH为10.5，浓度为100mmol/L的碳酸钠缓冲液中，再加入1mL无水乙醇和浓度为2mol/L的二硫苏糖醇50μL，混合均匀，现用现配。其具体检测方法为：1.取发酵液，于12,000转离心2分钟，取上清；2.取100μL上清液加入100μL，pH为8.0，浓度为100g/L，已于40℃预热的N-乙酰氨基葡萄糖溶液中，混匀，反应2分钟；3.加入100μL，浓度为0.5mol/L的盐酸溶液终止反应；4.取5μL反应液，加入95μL，pH为8.0的磷酸缓冲液中，混匀；5.从缓冲液中取5μL液体，加入到95μLOPA检测试剂中，震荡1min，利用酶标仪检测其在330nm处的吸光值。对照组使用培养基代替发酵液，其余操作相同。该检测方法虽然可以较为准确的检测出经催化反应后生成氨基葡萄糖的含量，但在检测过程中需要进行离心、混合、终止、稀释、检测等多步操作，操作繁琐且消耗大量试剂及试管。在对重组菌株和己丁二糖脱乙酰酶进行工程改造时，往往会产生大量不同的突变体。在对大量发酵液进行检测时，该检测方法由于自身操作的复杂性，难免会影响实验的效率。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种快速检测氨基葡萄糖的方法，仅需一步添加试剂混合操作，培养后即可由酶标仪进行检测。本专利技术的第一个目的是提供一种快速检测氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：S1、配制N-乙酰氨基葡萄糖溶液，在溶液中加入没食子蓝，得到没食子蓝检测试剂；S2、向含有氨基葡萄糖生产菌株的发酵液中加入没食子蓝检测试剂，培养后检测荧光强度，根据荧光强度降低判断氨基葡萄糖含量。进一步地，所述的氨基葡萄糖生产菌株是表达己丁二糖脱乙酰酶的菌株。进一步地，所述的没食子蓝检测试剂中N-乙酰氨基葡萄糖的浓度为50～150g/L。进一步地，所述的没食子蓝检测试剂中没食子蓝的浓度为50～150μmol/L。进一步地，所述的N-乙酰氨基葡萄糖溶液的pH为7.5～8.5。进一步地，S2步骤中，培养的条件是在35～38℃培养5～20分钟。进一步地，发酵液与没食子蓝检测试剂的体积比为1:0.5～2。进一步地，所述的荧光强度通过酶标仪进行检测。进一步地，酶标仪检测荧光强度时，激发波长为560nm。进一步地，酶标仪检测荧光强度时，发射波长为640nm。本专利技术的有益效果是：本专利技术快速检测氨基葡萄糖的方法，主要应用于测量发酵液中，可将底物N-乙酰氨基葡萄糖转化为氨基葡萄糖的己丁二糖脱乙酰酶的总催化活性。与现有的邻苯二甲醛检测方法不同，本专利技术的检测方法仅需一步添加试剂混合操作，培养后即可由酶标仪进行检测。相较于现有方法，本方法简单高效，可以明显提升实验效率。附图说明：图1为邻苯二甲醛试剂检测氨基葡萄糖产量；图2为没食子蓝试剂检测氨基葡萄糖产量。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。实施例1：检测试剂为没食子蓝检测试剂，其具体的配置方法为：配制pH为8.0，浓度为100g/L的N-乙酰氨基葡萄糖溶液，在溶液中加入1％浓度为10mmol/L的没食子蓝(终浓度为100μmol/L)。检测方法为：1、取50μL发酵液于96孔板中；2、加入50μL检测试剂，37℃培养10分钟；3、用酶标仪进行荧光检测，激发波长为560nm，发射波长为640nm。实施例2：为验证本检测方法的准确性，在此实施例中，我们分别培养了己丁二糖脱乙酰酶的高表达菌株和无表达菌株(对照菌株)两种菌株，并在培养24h、48h、72h和96h时，采用本专利技术所述的方法和已有的邻苯二甲醛检测方法对发酵液中总酶活进行检测。结果如图1、图2所示。结果表明，在培养72h后，产酶的菌株表现出较高的总酶活，并在培养96h后继续有所提升。而使用本专利技术提出的检测试剂也可以有效检测出产酶量的高低，且随酶活的提升荧光强度下降。此实施例证明了，本方法操作简便且能有效区分酶活高低，可适用于针对氨基葡萄糖生产的酶或菌株改造过程中的高通量筛选。以上所述实施例仅是为充分说明本专利技术而所举的较佳的实施例，本专利技术的保护范围不限于此。本
的技术人员在本专利技术基础上所作的等同替代或变换，均在本专利技术的保护范围之内。本专利技术的保护范围以权利要求书为准。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测氨基葡萄糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、配制N-乙酰氨基葡萄糖溶液，在溶液中加入没食子蓝，得到没食子蓝检测试剂；/nS2、向含有氨基葡萄糖生产菌株的发酵液中加入没食子蓝检测试剂，培养后检测荧光强度，根据荧光强度降低判断氨基葡萄糖含量。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速检测氨基葡萄糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、配制N-乙酰氨基葡萄糖溶液，在溶液中加入没食子蓝，得到没食子蓝检测试剂；
S2、向含有氨基葡萄糖生产菌株的发酵液中加入没食子蓝检测试剂，培养后检测荧光强度，根据荧光强度降低判断氨基葡萄糖含量。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氨基葡萄糖生产菌株是表达己丁二糖脱乙酰酶的菌株。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的没食子蓝检测试剂中N-乙酰氨基葡萄糖的浓度为50～150g/L。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的没食子蓝检测试剂中没食子蓝的浓度为50～150μmol/L。
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，吕雪芹，堵国成，李江华，刘延峰，孙国运，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32