一种巢式重组酶-聚合酶扩增的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种一步法、快速、高灵敏度的巢式重组酶‑聚合酶扩增的方法、以及核酸快速检测的方法、用于巢式重组酶‑聚合酶扩增方法的试剂盒。相比于传统巢式RPA的两步法反应，本发明专利技术通过引入特殊的修饰方法，将两对引物同时加入到反应体系中，一步完成核酸的快速扩增和/或检测。同时，本发明专利技术配合470nm单色LED灯以及滤光片可以通过裸眼判断检测结果，全程无需打开反应管。

【技术实现步骤摘要】
一种巢式重组酶-聚合酶扩增的方法及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种一步法、快速、高灵敏度的巢式重组酶-聚合酶扩增的方法、以及核酸快速检测的方法、用于巢式重组酶-聚合酶扩增方法的试剂盒。
技术介绍
重组酶-聚合酶扩增技术(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。最初由ASMscientific,Inc.于2003年申请专利(EP1499738B1)。此类扩增反应又被称为recombinase-aidamplification(RAA)，MultienzymeIsothermalRapidAmplification(MIRA)和体温扩增技术(STAMP)。其基本原理都为重组酶与引物形成组合体(filament)，入侵到底物核酸templatestrand进行，对双链进行打开，结合到引物互补的部位；接着具有strandeddisplacement能力DNA聚合酶作用下，在引物3’端开始合成互补链。Displaced的单链由单链结合蛋白所结合，组装原双链的复合。以上扩增反应已经被商业化，用来检测目的片段和核酸，通常也配有标签probe来提高特异性。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶，其基本原理为：重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物(filament)，入侵到底物核酸templatestrand进行，能在双链DNA中寻找同源序列，一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，在DNA聚合酶作用下，在引物3’端开始合成互补链，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被置换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。RPA检测技术的关键在于扩增引物和探针的设计。目前，荧光法RPA采用一步加入一对引物和一条探针，操作简单，灵敏度低，荧光强度弱。NestRPA采用分两步分别加入外引物对和内引物对(含探针)，灵敏度高，操作复杂，中间涉及到产物转移，有产物泄露污染风险。然而，为保证灵敏度高，达到无泄漏风险的前提下，简化步骤获得了本申请的One-potNestRPA，可以一步同时加入四条引物/探针，操作简单，无开盖泄露风险，灵敏度高，荧光强度高，可实现肉眼可视化检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种一步法、快速、高灵敏度的巢式重组酶-聚合酶扩增的方法(命名为One-potNestRPA)、以及核酸快速检测的方法、用于巢式重组酶-聚合酶扩增方法的试剂盒。可快速、高灵敏度的对核酸进行检测，反应过程无需配制两个RPA反应试剂，而且，两对引物可以一步同时加入反应体系中，避免开盖泄露风险，以及减少操作的复杂性。本专利技术的第一方面，提供了一种巢式重组酶-聚合酶扩增的方法，所述的方法包括：配制反应体系，加入1)第一引物对，和，2)第二引物对和/或探针；进行RPA或RT-RPA反应扩增；其中，第二引物对位于所述第一引物对RPA或RT-RPA反应扩增获得的模板内，所述的第二引物对包含/idSp/酶切位点和阻止3’端扩增的修饰。优选的，所述的1)第一引物对，和，2)第二引物对和/或探针，为一步加入。该方法中，两对引物同时加入，靠外面的第一引物对先进行反应，通过Exo(exonucleaseIII)或nfo(EndonucleaseIV)等酶切第二引物对，产生可以扩增的3’OH末端，继续进行扩增反应。优选的，所述的阻止3’端扩增的修饰可以为任何不适合DNA聚合酶扩增的3’端修饰。优选3’端OH被化学阻碍的非自然脱氧核苷酸及其修饰或者与3’端互补的DNA-OH。其中，所述的非自然脱氧核苷酸例如羟甲基叠氮。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的阻止3’端扩增的修饰选自羟甲基叠氮、C18、C12、ddNTP、RNA、PNA或C3spacer。优选的，所述的RPA或RT-RPA反应中添加能够识别/idSp/的核酸内切酶，所述的核酸内切酶优选为Exo(exonucleaseIII)或nfo(EndonucleaseIV)。优选的，所述的第二引物对和/或探针还包含荧光报告基团和荧光淬灭基团的修饰，所述的荧光报告基团选自FAM(6-carboxy-fluorescein，6-羧基荧光素)、HEX(hexachlorofluorescein，六氯-6-甲基荧光素)、TET(Tetrachlorofluorescein，四氯-6-羧基荧光素)、JOE(2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素)、Cy3(Indodicarbocyanine)或TAMRA(Carboxytetramethylrhodamine，6-羧基四甲基若丹明)，所述的荧光淬灭基团选自DABCYL(4-(4-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸)、BHQ1(BlackHoleQuencher1)、BHQ2(BlackHoleQuencher2)、BHQ3(BlackHoleQuencher3)Eclipse或MGB(MinorGrooveBinder，小沟结合)。优选的，所述的荧光报告基团修饰在第二引物对上游引物序列5′端碱基数25-35bp的位置上。优选为29-31bp的位置上。优选的，所述的荧光淬灭基团修饰在第二引物对下游引物序列离3′端碱基数10-20bp的位置上。优选为13-18bp的位置上。优选的，所述的荧光报告基团与荧光淬灭基团之间间隔1-3个碱基。优选间隔的碱基包含四氢呋喃(THF)。优选的，所述的/idSp/修饰在荧光报告基团与荧光淬灭基团之间。优选的，所述的第二引物对和/或探针中的idSp被nfo或exo切割后，产生可以扩增的3’OH末端，继续进行扩增反应。优选的，所述的第二引物对与所述第一引物对不重叠或小于10bp的重叠。优选的，所述的RPA或RT-RPA反应分别可用于DNA或RNA的扩增。优选的，所述的RPA或RT-RPA反应时间为5-40min，优选为30min。优选的，所述的RPA或RT-RPA反应温度为35℃-45℃，优选的是37℃-42℃。优选的，所述的RPA或RT-RPA反应在反应试剂中进行，所述的反应试剂包括第一引物对、第二引物对、缓冲液和/或RPA反应物。所述的RPA反应物可以是商业化的任意的RPA反应所需的试剂或试剂盒等，也可自行实验室进行配制获得的RPA反应所需的试剂，其可以是液体，也可以是干粉。优选包括重组酶、聚合酶以及单链结合蛋白等等。优选的，所述的反应试剂还包含选自醋酸镁、DEPC水、缓冲液、PEG和/或裂解液。裂解液可以是商业化的任意的裂解液试剂或试剂盒等，也可自行实验室进行配制获得的裂解液。优选的，所述的方法还包括观察检测结果的步骤。进一步优选的，所述的观察检测结果的步骤包括使用470nmLED灯和/或滤光片，然后通过裸眼判断检测结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种巢式重组酶-聚合酶扩增的方法，其特征在于，所述的方法包括：/n配制反应体系，加入1)第一引物对，和，2)第二引物对和/或探针；/n进行RPA或RT-RPA反应扩增；/n其中，第二引物对位于所述第一引物对RPA或RT-RPA反应扩增获得的模板内，所述的第二引物对包含/idSp/酶切位点和阻止3’端扩增的修饰。/n

【技术特征摘要】
1.一种巢式重组酶-聚合酶扩增的方法，其特征在于，所述的方法包括：
配制反应体系，加入1)第一引物对，和，2)第二引物对和/或探针；
进行RPA或RT-RPA反应扩增；
其中，第二引物对位于所述第一引物对RPA或RT-RPA反应扩增获得的模板内，所述的第二引物对包含/idSp/酶切位点和阻止3’端扩增的修饰。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的阻止3’端扩增的修饰选自羟甲基叠氮、C18、C12、ddNTP、RNA、PNA或C3spacer。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的1)第一引物对，和，2)第二引物对和/或探针，为一步加入。


4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述的RPA或RT-RPA反应中添加能够识别/idSp/的核酸内切酶，所述的核酸内切酶优选为Exo或nfo。


5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的第二引物对和/或探针还包含荧光报告基团和荧光淬灭基团的修饰，所述的荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、Cy3或TAMRA，所述的荧光淬灭基团选自DABCYL、BHQ1、BHQ2或BHQ3、Eclipse、MGB。


6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述的第二引物对和/或探针中的/idSp/被nfo或exo切割后，产生可以扩增的3’OH末端，继续进行扩增反应。


7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述的第二引物对与所述第一引物对不重叠或小于10bp的重叠。


8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述的RPA或RT-RPA反应分别可用于DNA或RNA的扩增。


9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述的RPA或RT-RPA反应时间为5-4...

【专利技术属性】
技术研发人员：白净卫，刘册，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11