一种SARS-CoV-2检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开一种新型的SARS‑CoV‑2基因组比色检测方法，包括以下步骤：采用RT‑RPA工艺可在等温条件下实现短时间内靶标的指数扩增；Cas12a结合诱导的切割性质将检查扩增拷贝的准确性和针对靶序列的反应特异性；利用ssDNA修饰的AuNPs作为通用的结果输出，可直接通过肉眼观察检测结果。本发明专利技术还公开一种SARS‑CoV‑2检测试剂盒，包括RPA扩增用试剂、Cas12a、crRNA、缓冲液1×NEBuffer

【技术实现步骤摘要】
一种SARS-CoV-2检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于纳米
，具体涉及一种SARS-CoV-2检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)，是导致新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的病原体。虽然疫苗的研制正在进行中，但诊断在感染预防和流行病控制中仍然起着至关重要的作用。基于SARS-CoV-2基因组特异性序列的识别，逆转录(RT)PCR技术发展迅速，已成为SARS-CoV-2检测的主要手段。在典型的RT-PCR测定过程中，病毒RNA被逆转录为互补DNA(cDNA)，然后通过温度循环实现指数放大。尽管RT-PCR已被广泛使用，但有若干限制仍需改进。比如，取样和操作程序导致的高假阴性率。此外，对训练有素的工作人员和昂贵的实验室仪器的依赖可能会妨碍在设备不健全区域的实际应用以及POC诊断。重组酶聚合酶扩增(RPA)具有与PCR相似的灵敏度，RPA可在单一温度下操作，已被用于核酸检测。特别是，通过结合CRISPR技术，等温扩增方法已成功应用于SARS-CoV-2检测。据报道，Cas9、Cas12a、Cas13和Cas14在目标核酸的位点特异性结合后都表现出非特异性的反式切割活性，从而赋予了CRISPR/Cas系统开发精确和便携式诊断工具的巨大潜力。因此，就操作成本和检测稳健性而言，DNA响应型Cas12a可能在SARS-CoV-2的POC技术开发中提供更多优势。然而，大多数基于CRISPR的策略都依赖于昂贵的双标记荧光报告基因和荧光检测设备。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在问题或不足，本专利技术提供一种SARS-CoV-2检测试剂盒及检测方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术的实施例提供一种新型的SARS-CoV-2基因组比色检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用RT-RPA工艺在等温条件下实现短时间内靶标指数放大；(2)Cas12a结合诱导的非特异性切割能力将检查扩增产物的准确性并特异性的针对靶序列响应；(3)利用ssDNA修饰的AuNPs作为通用的结果输出方式，可肉眼直接观察检测结果。Cas12a可对与crRNA结合的双链DNA表现出位点特异性的切割活性(顺式切割)，随后不加区别地进行ssDNA水解(反式切割)。通过整合RT-RPA偶联的Cas12a系统和AuNPs的光学特性，本专利技术的检测方法中，被ssDNA覆盖的AuNPs充当Cas12a切割的通用底物。在没有SARS-CoV-2基因组的情况下，Cas12a没有活性，AuNPs保持良好的分散状态。当通过RT-RPA扩增病毒基因组时，所得大量dsDNA将经历crRNA引导的结合以激活Cas12a。在反式裂解下，被修饰的ssDNA链逐渐被水解，AuNPs将发生聚集，导致SPR发生变化。整体检测在均质溶液中进行，无需任何分离或加热循环过程，从而大大提高了POC检测COVID-19的可行性。进一步的，所述检测方法可以特异性靶向由两对引物和相应的crRNA介导的SARS-CoV-2基因组的ORF1ab和N区。进一步的，所述检测方法的靶标线性响应浓度为10pM至100nM。本专利技术的实施例还提供了一种SARS-CoV-2检测试剂盒，其特征在于，包括RPA扩增用试剂、Cas12a、crRNA、缓冲液1×NEBufferTM2.1和ssDNA修饰的AuNPs。进一步的，所述RPA扩增用试剂包括OFR1ab正向引物、OFR1ab反向引物、Nregion正向引物、Nregion反向引物、RNA逆转录酶与Rnase抑制剂及RPABasic试剂盒。上述的，OFR1ab正向引物的序列为：5’-TACACCGGAAGCCAATATGGATCAAGAATC-3’；OFR1ab反向引物的序列为：5’-CATTAGCACAAGTTGTAGGTATTTGTACATAC-3’；Nregion正向引物的序列为：5’-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3’；Nregion反向引物的序列为：5’-AGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3’。进一步的，所述OFR1ab正向引物和Nregion正向引物的体积为2.4μL，所述OFR1ab正向引物和Nregion正向引物的浓度为10μM，所述OFR1ab反向引物和Nregion反向引物的体积为2.4μL，所述OFR1ab反向引物和Nregion反向引物浓度为10μM。进一步的，所述Cas12a的体积为4-6μL，所述crRNA的体积为8-10μL，所述1×NEBufferTM2.1的体积为100-150μL；所述Cas12a和crRNA的最终浓度分别为4μM和8μM。本专利技术的实施例另外还提供一种SARS-CoV-2检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：将病毒基因组通过RPA扩增用试剂进行RT-RPA扩增；将Cas12a和crRNA分别添加到1×NEBufferTM2.1中，在37℃下孵育10分钟后，扩增产物包含大量的dsDNA，将结合并激活Cas12a；在反式裂解作用下，修饰的ssDNA底物将从AuNPs上逐渐被水解，造成表面等离子共振(SPR)变化，可通过紫外吸光光谱和裸眼观察进行监测。本专利技术的上述技术方案的有益效果如下：(1)本专利技术的检测试剂盒及检测方法利用ssDNA修饰的金纳米粒子(AuNPs)作为通用比色信号输出方式，可以专门靶向SARS-CoV-2基因组的ORF1ab和N区域；病毒基因组通过RT-RPA扩增后，由此产生的大量dsDNA将结合并激活Cas12a。在反式裂解作用下，ssDNA作为底物将被裂解并从AuNPs上脱离，AuNPs产生表面等离子共振(SPR)的变化，可以通过紫外吸光光谱和裸眼观察进行监测。(2)本专利技术的检测试剂盒及检测方法，利用RT-RPA的高效率扩增和Cas12a反式切割作用，使检测灵敏度高达1个拷贝的病毒基因组序列。在等温扩增和Cas12a激活过程的双重变异检测下，可以有效避免其他β冠状病毒成员的假阳性事件，从而显著提高特异性。本专利技术能够对ORF1ab和N基因区域的有效响应均可低至1个拷贝，这种高灵敏度确保了我们的方法在COVID-19POC诊断中的巨大应用潜力。(3)本专利技术的实施例中，通过医院检验科的标准临床样品，验证了该比色法的可靠性，通过肉眼观察溶液的颜色变化，可以清楚地观察到阳性结果，极大的简便了检测过程。通过将RPA/Cas12a系统固有的高灵敏度和特异性与基于AuNPs的比色法的简单性相结合，我们所建立的方法具有SARS-CoV-2检测的实用性。(4)本专利技术由于Cas12a介导的催化作用，具有很高的灵敏度，通过配合RT-RPA的预扩增过程，其在COVID-19诊断中具有巨大的潜力。(5)本专利技术的实施例中通过对严重急性呼吸综合征(SARS-CoV)和中东呼吸综合征(MERS-CoV)序列以及临床标准SARS-CoV-2基因组样本进行了测试，验证了该方法的可靠性，RPA和Cas12a的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型的SARS-CoV-2基因组比色检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用RT-RPA工艺实现等温条件下短时间内靶标的指数扩增；(2)Cas12a结合诱导的切割性质将检查扩增拷贝的准确性和针对靶序列的反应特异性；(3)利用ssDNA修饰的AuNPs作为通用的结果输出，可直接通过肉眼观察检测结果。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型的SARS-CoV-2基因组比色检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用RT-RPA工艺实现等温条件下短时间内靶标的指数扩增；(2)Cas12a结合诱导的切割性质将检查扩增拷贝的准确性和针对靶序列的反应特异性；(3)利用ssDNA修饰的AuNPs作为通用的结果输出，可直接通过肉眼观察检测结果。


2.根据权利要求1所述的一种新型的SARS-CoV-2基因组比色检测方法，其特征在于，所述检测方法可以特异性靶向两对引物所对应的SARS-CoV-2基因组的ORF1ab和N区。


3.根据权利要求1所述的一种新型的SARS-CoV-2基因组比色检测方法，其特征在于，所述检测方法的线性响应靶标浓度为10pM至100nM。


4.一种SARS-CoV-2检测试剂盒，其特征在于，包括RPA扩增用试剂、Cas12a、crRNA、缓冲液1×NEBufferTM2.1和ssDNA修饰的AuNPs。


5.根据权利要求4所述的一种SARS-CoV-2检测试剂盒，其特征在于，所述RPA扩增用试剂包括OFR1ab正向引物、OFR1ab反向引物、Nregion正向引物、Nregion反向引物、RNA逆转录酶与Rnase抑制剂及RPABasic试剂盒。


6.根据权利要求5所述的一种SARS-CoV-2检测试剂盒，其特征在于，OFR1ab正向引物的序列为：
5’-TACACCGGAAGCCAATATGGATCAAGAATC-3’；
OFR1ab反向引物的序列为：
5’-CATTAGCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：于艳艳，苏高星，朱敏，张伟，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32