与猪感染PRRSV后抗病指示性状相关的分子标记及应用制造技术

本发明专利技术提供了与猪感染PRRSV后抗病指示性状相关的分子标记及应用，该分子标记包括位于猪DDX17基因第3内含子的SNP位点和/或BTG1基因第6内含子的SNP位点。本发明专利技术还公开了分别用于检测猪感染PRRSV后抗病指示性状相关的分子标记即扩增DDX17和BTG1基因内SNPs的检测试剂盒，该检测试剂盒也是用于检测本发明专利技术筛选分子标记的检测试剂盒。本发明专利技术建立了一种与猪抗病指示性状相关的分子标记多态性Tetra‑primerARMS‑PCR快速检测方法。关联分析应用表明，该标记可在猪感染PRRSV后抗病指标相关的检测中应用。本发明专利技术为猪抗病指示性状特别是为猪血液参数性状的标记辅助选择提供了新的SNP分子标记。

【技术实现步骤摘要】
与猪感染PRRSV后抗病指示性状相关的分子标记及应用
本专利技术属于猪分子标记的筛选与应用
，具体涉及与猪感染PRRSV后抗病指示性状相关的分子标记及应用。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合症(PRRS，porcinereproductiveandrespiratorysyndrome)是严重危害全球养猪业的传染病之一，以母猪繁殖障碍和各年龄段猪呼吸道疾病为主要特征，每年给我国生猪养殖带来巨大经济损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)通过抑制天然免疫、延迟中和抗体产生等多种途径抑制机体免疫应答，导致病毒持续性感染，进而引起严重的细菌继发感染，给其他传染病带来可乘之机。如何通过从遗传水平来选择对PRRSV有较强抗病力的宿主，选育抗PRRSV的优良品种，对于防控PRRSV的大规模流行提供了一个研究途径，也是猪遗传育种改良工作的重点。血液参数指标具有非常重要的免疫功能指示作用，可以作为PRRS早期抗病性的生物性标记。PRRSV对宿主免疫应答具有抑制作用，感染早期(0～7天)，外周血中的白细胞数、单核细胞数、淋巴细胞数显著下降，淋巴细胞百分比降低；感染后期(7～21天)，机体通过激活免疫应答清除病毒，各血液参数指标逐渐恢复至正常(Shietal.2008；张文利等，2015；Lietal.2016；Ferrarietal.2018)。申请人课题组前期通过西方商业猪种大白猪和中国地方猪种通城猪的PRRSV人工感染试验发现，通城猪在各项免疫指标、临床病变情况等多个性状上均表现更强的抗病力。在PRRSV感染早期，通城猪的淋巴细胞百分比显著高于大白猪，大白猪免疫抑制更强烈，通城猪则有积极的免疫应答(Liangetal.2016)。申请人课题组以大白猪×通城猪高代横交群体为研究对象，通过PRRSV人工感染，根据感染后第14天个体存活情况划分易感组和抗病组，结果显示易感个体感染后第7天的淋巴细胞百分比极显著低于抗病个体，且淋巴细胞百分比与血清中病毒载量显著负相关，可作为PRRS早期抗病性的指示性状(王媛等，2020)。虽然淋巴细胞百分比是一种重要的抗病指示性状，但其必须在病毒感染后才能检测，如何能找到与淋巴细胞百分比相关也就是免疫相关性状的分子标记，这是一个技术难题，如果能通过检测免疫相关性状的分子标记可在疾病发生前筛选抗病个体，这将为猪的抗病育种提供理论依据。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供与猪感染PRRSV后抗病指示性状相关的分子标记。本专利技术发掘了猪DDX17基因的第3内含子和BTG1基因的第6内含子可作为与PRRSV感染后血液参数性状相关的分子标记，为猪抗病指示性状的分子标记辅助育种提供了2个新的分子育种标记。专利技术的目的之一在于提供与猪感染PRRSV后抗病指示性状相关的分子标记，该分子标记包括位于猪DDX17基因第3内含子的SNP位点和/或BTG1基因第6内含子的SNP位点，所述猪DDX17基因第3内含子的SNP位点即rs81257542，如SEQIDNO.1所示核苷酸序列第258位碱基R为A或C的等位基因突变；所述猪BTG1基因第6内含子的SNP位点即rs334594334，如SEQIDNO.2所示核苷酸序列第297位碱基W为A或T的等位基因突变。本专利技术的目的之二在于提供如上所述的分子标记在制备鉴定猪抗病相关性状和遗传育种辅助选择试剂中的应用。如上所述的应用，优选地，在SEQIDNO.1所示的核苷酸序列第258位的碱基R为C是猪感染PRRSV抗病性强的指示；在SEQIDNO.2所示的核苷酸序列第297位的碱基W为A是猪感染PRRSV抗病性强的指示。本专利技术的目的之三在于建立上述猪感染PRRSV后抗病指示性状相关分子标记(rs81257542和rs334594334)的快速检测试剂盒，其包括：(1)用于检测含rs81257542位点的扩增片段SEQIDNO.1所示序列的DDX17外引物对和DDX17内引物对，所述DDX17外引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示，DDX17内引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；(2)用于检测含rs334594334位点的扩增片段SEQIDNO.2所示序列的BTG1外引物对和BTG1内引物对，所述BTG1外引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示，BTG1内引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示。如上所述的快速检测试剂盒，优选地，其还包括下述试剂中的一种或多种：Taq酶、dNTPs、MgCl2、PCR缓冲液、双蒸水；或者还包括下述试剂中的一种或多种：TaqDNAMasterMix、双蒸水。本专利技术的目的之四在于提供使用所述检测试剂盒检测猪感染PRRSV后抗病指示性状相关SNP的方法，包括以下步骤：步骤1：提取待测样本中的基因组DNA；步骤2：以步骤1提取的DNA为模板，通过所述SEQIDNO.3～6、SEQIDNO.7～10所示的两组内外引物对分别对DDX17和BTG1基因构建Tetra-primerARMS-PCR扩增体系进行PCR扩增；步骤3：对PCR扩增产物进行电泳检测和结果判定。如上所述的方法，优选地，所述结果判定为：(A)对于DDX17基因检测中，若扩增片段为三条，大小分别为595bp、364bp、281bp，则判定该待测样本的个体基因型为杂合子AC；若扩增片段为两条，若分别为595bp、364bp，则判定该待测样本的个体基因型为纯合子CC；若分别为595bp、281bp，则判定该待测样本的个体基因型为纯合子AA；(B)对于BTG1基因检测中，若扩增片段为三条，大小分别为464bp、321bp、194bp，则判定该待测样本的个体基因型为杂合子TA；若扩增片段为两条，若分别为464bp、321bp，则判定该待测样本的个体基因型为纯合子TT；若分别为464bp、194bp，则判定该待测样本的个体基因型为纯合子AA。本专利技术的目的之五在于提供所述的检测试剂盒在鉴定影响猪免疫抗病性状中的应用。快速检测试剂盒在鉴定影响猪免疫抗病性状中的应用猪分子标记辅助育种中的应用。快速检测试剂盒在提高猪抗病力中的应用。分子标记rs81257542位点等位基因为C，且为纯合子CC基因型和/或rs334594334位点等位基因为A，且为纯合子AA基因型的检测个体对PRRSV感染具有更强的抗病力。通过选择rs81257542位点为CC基因型和/或rs334594334为AA基因型的个体留种，具有对PRRSV较强的抗病性，可提高群体抗病力，有助于猪的抗病育种。本专利技术从猪前腔静脉血液的白细胞中提取基因组DNA。登录NCBI数据库下载猪DDX17和BTG1基因的DNA序列，对DDX17基因的rs81257542位点、BTG1基因的rs334594334分别设计特异Tetr本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.与猪感染PRRSV后抗病指示性状相关的分子标记，其特征在于，该分子标记包括位于猪DDX17基因第3内含子的SNP位点和/或BTG1基因第6内含子的SNP位点，所述猪DDX17基因第3内含子的SNP位点即rs81257542如SEQ ID NO.1所示苷酸序列第258位的碱基R为A或C的等位基因突变，所述猪BTG1基因第6内含子的SNP位点即rs334594334如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第297位的碱基W为A或T的等位基因突变。/n

【技术特征摘要】
1.与猪感染PRRSV后抗病指示性状相关的分子标记，其特征在于，该分子标记包括位于猪DDX17基因第3内含子的SNP位点和/或BTG1基因第6内含子的SNP位点，所述猪DDX17基因第3内含子的SNP位点即rs81257542如SEQIDNO.1所示苷酸序列第258位的碱基R为A或C的等位基因突变，所述猪BTG1基因第6内含子的SNP位点即rs334594334如SEQIDNO.2所示核苷酸序列的第297位的碱基W为A或T的等位基因突变。


2.权利要求1所述的分子标记在制备鉴定猪抗病相关性状和/或遗传育种辅助选择试剂中的应用。


3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，在SEQIDNO.1所示的核苷酸序列第258位的碱基R为C是猪感染PRRSV抗病性强的指示；在SEQIDNO.2所示的核苷酸序列第297位的碱基W为A是猪感染PRRSV抗病性强的指示。


4.用于检测权利要求1所述猪感染PRRSV后抗病指示性状相关的分子标记的快速检测试剂盒，其特征在于，其包括：
(1)用于检测含rs81257542位点的扩增片段SEQIDNO.1所示序列的DDX17外引物对和DDX17内引物对，所述DDX17外引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示，DDX17内引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；
(2)用于检测含rs334594334位点的扩增片段SEQIDNO.2所示序列的BTG1外引物对和BTG1内引物对，所述BTG1外引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示，BTG1内引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示。


5.如权利要求4所述的快速检测试剂盒，其特征在于，其还包括下...

【专利技术属性】
技术研发人员：周翔，吴清清，刘榜，王媛，刘雯悦，付明，张庆德，官凯锋，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42