茶树WRKY29基因及其在提高植物抗寒性上的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了茶树WRKY29基因及其在提高植物抗寒性上的应用。茶树WRKY29基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；茶树WRKY29基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。茶树WRKY29的表达模式与茶树响应低温胁迫相关，将该基因超量表达转化植物，能够提高植物的耐寒性，通过反义寡核苷酸技术抑制CsWRKY29的表达，茶树叶片在低温下损伤明显加重。该基因的克隆不仅将有利于探究WRKY转录因子在茶树抗寒过程中的作用，而且有助于推动以增强茶树抗寒为目标的遗传改良进程，促进茶产业的可持续发展，本发明专利技术具有很大的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
茶树WRKY29基因及其在提高植物抗寒性上的应用
本专利技术涉及基因工程
，具体为茶树WRKY29基因及其在提高植物抗寒性上的应用。
技术介绍
茶树(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)是我国重要的经济作物。茶叶富含氨基酸、生物碱、茶多糖、多酚类和挥发类等物质，这些内含物含量和组分的不同，共同赋予了茶叶色、香、味等品质特征。中国茶区主要分为西南茶区、华南茶区、江南茶区、江北茶区，北方地区鲜有分布。近年来，越冬期及初春茶树频繁遭遇“霜冻”或“倒春寒”等低温伤害，茶树新稍受到损伤，影响茶叶的产量和品质，严重时甚至导致死亡。低温已逐渐成为制约茶树南种北移、茶叶产能增效的主要因素，影响产业的健康可持续发展。WRKY转录因子是近年来植物中发现包含成员最多的转录因子家族之一，在植物抗逆调控网络中扮演重要角色。大量的研究表明，WRKY转录因子参与植物生长发育，次级代谢以及产物合成等生物学过程。前人的研究表明，WRKY在植物抗逆以及防御反应中发挥积极作用。综上，WRKY转录因子广泛参与植物生物与非生物胁迫响应，并且扮演重要角色，然而，WRKY转录因子在茶树抗寒过程中的作用，鲜有报道。茶树作为一种喜温畏寒植物，低温严重制约了茶叶的品质以及茶产业的发展。随着茶树基因组数据的公布，为我们从分子水平解析茶树WRKY转录因子夯实了数据基础。利用生物信息学以及分子生物学对茶树WRKY转录因子进行分析验证，揭示茶树WRKY转录因子在茶树低温胁迫响应中的作用，为茶树的抗逆工程育种提供更好的基础与证据。r>
技术实现思路
本专利技术的目的在于：提供茶树WRKY29基因及其在提高植物抗寒性上的应用，丰富了茶树中转录因子的研究，为茶树抗寒机制提供了新思路，为实现茶树抗性性状育种提供了理论和实际参考基础。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种茶树WRKY29基因，所述茶树WRKY29基因为茶树WRKY类转录因子基因，所述茶树WRKY29基因的核苷酸序列，如序列表SEQIDNO.1所示。优选地，所述茶树WRKY29基因编码的蛋白序列，如序列表SEQIDNO.2所示。优选地，所述茶树WRKY29基因，及其编码的蛋白质，应用于植物响应低温胁迫过程中的调控作用，提高植物的耐寒性。本专利技术的有益效果在于：本专利技术中，首次克隆并验证了调控茶树响应低温胁迫的WRKY类转录因子茶树WRKY29基因(即CsWRKY29)，该转录因子在茶树响应低温胁迫过程中实现调控作用，影响茶叶的抗寒属性和品质的形成。本专利技术还提供了含有CsWRKY29基因的重组质粒、转基因工程菌。本专利技术丰富了茶树中转录因子的研究，为茶树抗寒机制提供了新思路，为实现茶树抗性性状育种提供了理论和实际参考基础。附图说明图1：为茶树不同组织中CsWRKY29编码蛋白的表达差异以及4℃低温处理下的表达变化图；图2：为CsWRKY29在烟草叶片中的亚细胞定位图；图3：为CsWRKY29在拟南芥过表达株系和野生型中的表达分析以及过表达株系在低温处理下的表型和丙二醛含量分析图；图4：为体外反义寡核苷酸抑制CsWRKY29的植株受损叶绿素荧光图、Fv/Fm值以及丙二醛含量分析图。具体实施方式在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本专利技术。应理解，这些实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。实施例1：1、CsWRKY29基因的克隆与序列结构分析茶树WRKY29基因(即CsWRKY29基因)，为茶树WRKY类转录因子基因，其克隆与序列结构分析，具体如下：茶树国家级良种舒茶早种植于安徽省庐阳区合肥安徽农业大学农业产业园，取幼嫩叶片用于RNA的提取。总RNA的抽提采用RNAprepPurePlantKit(Tiangen,Beijing,China)试剂盒按照说明操作，用分光度计检测其RNA含量和质量。反转录生成第一链：取1μgRNA作模板，根据PrimeScriptII1stStrandcDNASynthesisKit(TakaraBiotech,China)试剂盒说明配置，加入OligodTPrimer(50μM)0.6μl，Random6mers(50μM)0.4μl，dNTPMixture(10mMeach)1μl，RNaseFreedH2O补足至10μl，65℃变性5min，立即在冰上放置。然后在上述反应液中加入5×PrimerScriptbuffer4μl，RNaseInhibitor(40U)0.5μl，PrimerScriptRTase(200U)1μldH2O水补足20μl，42℃温育45min，95℃5min灭活反转录酶。经过优化后，取适量的反转录产物用于随后的PCR。以cDNA第一链作为RT-PCR模板，常规方法做PCR，扩增CsWRKY29基因。其中上游引物：(5’-ATGGCCCAAGGAAGAAGTG-3’)，下游引物：(5’-CTAATTCCCCATAAAACTTG-3’)。25μlPCR反应体系为：10×Extaqbuffer2.5μl，dNTP2.0μl，Mg2+1.5μl，上、下游引物各1μl，Extaq0.2μl，模板1μl，ddH2015.8μl。反应程序如下为：98℃10sec，98℃10sec，57℃30sec，72℃2min，72℃10min，35个循环。PCR产物CsWRKY29基因经纯化回收后，连接到pGEM-TEasyVector载体(Promega，Shanghai，China)上得到pGEM-TEasy::CsWRKY29质粒，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，送通用公司测序，得到的CsWRKY29基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示，具体如下：ATGGCCCAAGGAAGAAGTGAACTCTCAATTGATTCAGATCGGATCGGATTATTCCTATACCACCCAACTGTCATCAATTCATTTCCCGGCGACAACCACCACCACCACCTCCGCCACCATCACCACCATCACCACCGTCCCAAGCTCAAGTTTGAACCCATGGAAATGGAACCAACCACCACCAGGTCACCGATAAAAACCATCCAATTCCCAGTCAATCTCAACTGCACCACCACCACCACCTCCGATCAAGACATTCCCACGCCGTCCGATCACAATCATCGCACGGTCATCGACGAGATGGACTTCTTCGCCCAGAATAAAAAACATGACGATGACTCCAAGGCTACAGCCACCACCGTTGCCGCCGATCGACCAC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种茶树WRKY29基因，其特征在于，所述茶树WRKY29基因为茶树WRKY类转录因子基因，所述茶树WRKY29基因的核苷酸序列，如序列表SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种茶树WRKY29基因，其特征在于，所述茶树WRKY29基因为茶树WRKY类转录因子基因，所述茶树WRKY29基因的核苷酸序列，如序列表SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的茶树WRKY29基因，其特征在于，所述茶树WRKY...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏恩华，赵慧娟，童伟，吴琼，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34