CAMTA3基因及其在植物中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种CAMTA3基因及其在植物中的应用。提供了CAMTA3基因或其活性片段在促进RNA沉默中的用途。植物体内敲除CAMTA3基因后会显著降低植物体内RNA沉默通路，使得植物对病毒更敏感，CAMTA3基因能够显著促进植物体内RNA沉默信号通路；而且camta3基因敲除植株中，利用农杆菌瞬时过表达外源蛋白，能够使得外源蛋白的量有显著提高，从而可以用来在植物体内过表达蛋白或者应用于植物抗病育种领域。

【技术实现步骤摘要】
CAMTA3基因及其在植物中的应用
本专利技术涉及植物育种领域，具体涉及一种CAMTA3基因及其在植物中的应用，尤其涉及CAMTA3基因在植物抗病育种领域中的用途。
技术介绍
植物作为不能瞬时移动的生物体，在其生长周期中会受到来自各种外界病原菌的侵染，作为无法使用抗生素抑制的病原菌，植物病毒能够通过多种途径传播并造成植物的终身带毒和毁灭性的伤害。双生病毒作为最大的一类植物DNA病毒，近年来广泛引起人们的关注(Fauquetetal.,2008)。双生病毒科(Geminiviridae)包含了300多个独立的种，因其特有的孪生颗粒形态的单链环状DNA(single-strandDNA，ssDNA)而得名。双生病毒可以通过烟粉虱、叶蝉等昆虫传播。双生病毒可以侵染多种寄主作物，包括黄秋葵、木薯以及重要的经济作物烟草、棉花、番茄等，侵染植物后可引起植物叶片卷曲、畸形发育；叶脉膨胀突出等典型症状(Mansooretal.,2006)。双生病毒复制快，能够短时间产生大量的病毒，且病毒基因组易变异，所以经常会导致病毒的大流行和大爆发(GibbsandOhshima,2010)。据不完全统计，全球有接近50个国家和地区受到双生病毒的肆虐(Pereiraetal.,2010；Scholthofetal.,2011b)。研究和防治双生病毒成为热点。RNA沉默(RNAsilencing，RANi)是指真核生物通过小RNA(smallRNA，sRNA)靶向基因mRNA从而调节基因的表达的机制。RNA沉默作为生物界保守的防御机制在动物和植物的发育、抗逆境胁迫等方面具有至关重要的作用(Brodersenetal.,2008；ChinnusamyandZhu,2009；HeoandKim,2009)。植物运用基因沉默手段主要想达到三个目的：1.创造和维持异染色质，使重复的染色体不会被表达；2.通过调节内源基因表达来促进生长发育、逆境胁迫等生物学过程；3.抵御外来的病原微生物。病毒主要依赖于寄主细胞的复制翻译系统进行自身遗传物质的扩增和传递并且病毒能够在短时间内大量复制自身遗传物质或转录出病毒蛋白mRNA，这些特质使得RNA沉默成了植物、动物和真菌抗病毒的重要防御机制。通过RNA沉默调控植物内基因表达，从而改善基植物性能，还需要进一步改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。本专利技术涉及一个正调控植物抗双生病毒的基因CAMTA3基因。专利技术人在研究过程中创造性地发现当植物体内敲除CAMTA3(也可以称为camta3)后会显著降低植物RNA沉默通路，使得植物对病毒，例如双生病毒、李痘病毒等更敏感；所以CAMTA3基因能够显著促进植物体内RNA沉默信号通路。而且专利技术人在研究过程中发现：camta3基因缺失植物中，利用农杆菌瞬时过表达外源蛋白如GFP蛋白，能够使得外源蛋白的量有显著的提高，从而可以用来应用camta3基因缺失或者功能沉默植物来进行蛋白表达，从而可以用来获得高产量的蛋白或者研究蛋白功能或者增强植物抗性。钙调蛋白结合转录因子(Calmodulin-bindingactivator3，CAMTA)是一类结构保守、在各种真核生物中都广泛存在的基因表达调控蛋白。近年来不断有报道揭示出CAMTA家族蛋白在植物的生长发育、抗逆胁迫、低温抗冻和植物激素合成途径等方面起到的关键作用。CAMTA是一个多基因家族：拟南芥(Arabidopsis)有6个CAMTA成员，其中主效基因是CAMTA3。水稻(Oryzasativa)有7个成员，大豆(Glycinemax)有15个成员而番茄(Solanumlycopersicum)至少有7个成员(Boucheetal.,2002；Choietal.,2005；Yangetal.,2012)。CAMTA家族的转录因子都具有较为保守的功能域：从N端依次排列着一个CG-1DNA结合结构域、一个TIG(transcriptionfactorimmunoglobulin)结构域、ANK重复(ankyrinrepeat)结构域、一个Ca2+依赖型CaM结合结构域(Ca2+-dependentCaMbindingdomain，CaMBD)和串联重复的IQ基序(IQmotif，IQXXXRGXXX)。AtCAMTA3的CG-1DNA结合结构域主要是结合在基因启动子的“CGCG盒”区域(CGCG-box)，即[A/C/G]CGCG[T/C/G]和[A/C]CGTGT(Poovaiahetal.,2013；YangandPoovaiah,2002)。本专利技术专利技术人在研究过程中发现，病毒依靠伤口或昆虫噬咬入侵植物时，植物会迅速激起钙流，进而激活CAMTA3。被激活的CAMTA3能够直接结合到RNA沉默通路中核心基因RDR6的启动子区域，并促进其转录。发现当植物体内敲除CAMTA3(camta3)后会显著降低植物RNA沉默通路，使得植物对双生病毒更敏感；而且使得利用农杆菌在烟草中瞬时过表达的GFP蛋白的量在camta3植物中有显著提高。因此，本专利技术基因CAMTA3能应用于植物内过表达蛋白及植物抗病育种。本专利技术的第一方面提供了一种CAMTA3基因或其活性片段在促进RNA沉默中的用途。本专利技术发现昆虫叮咬以及机械损伤可以诱导沉默通路中核心基因RDR6的显著表达，并发现CAMTA3是其主要调控的上游转录因子。后续实验结果证实CAMTA3基因在抗病过程中起正调控作用及其抗病过程的分子机制，而且在camta3基因敲除植株中，利用农杆菌瞬时过表达外源蛋白，能够使得外源蛋白的量有显著提高，从而可以用来在植物体内过表达蛋白或者应用于植物抗病育种领域。因此，本专利技术不仅为植物抗病育种提供重要的理论支持，而且可将camta3基因敲除植株作为生物发生器在植物内过表达蛋白。本专利技术的第二方面提供了CAMTA3基因或其活性片段在植物抗病毒领域中的用途。本专利技术的第三方面提供了一种制备转基因植物的方法，包括：使得目标植物体内CAMTA3基因或其活性片段的表达水平与所述目标植物的野生型表现出差异，以便获得所述转基因植物。本专利技术的第四方面提供了一种促进外源蛋白在植物中表达的方法，包括：将外源蛋白的编码基因导入到所述植物体内，以便促进外源蛋白在所述植物中的表达，其中所述植物体内低表达或者不表达CAMTA3基因或其活性片段。本专利技术的第五方面提供了表达载体在RNA沉默中的用途，所述表达载体含有CAMTA3基因或其活性片段。本专利技术的第六方面提供了CAMTA3基因或其活性片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于促进RNA沉默。附图说明图1是根据本专利技术的实施例提供的昆虫叮咬及机械损伤后CAMTA3和RDR6基因的mRNA水平的变化结果图。图2是根据本专利技术的实施例提供的CAMTA3能直接结合到RDR6启动子区并促进其转录的结果验证图。图3是根据本专利技术的实施例提供的CAMTA3正向调控RNAi结果图。图4是根据本专利技术的实施例提供的CLCuMu本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.CAMTA3基因或其活性片段在促进RNA沉默中的用途。/n

【技术特征摘要】
1.CAMTA3基因或其活性片段在促进RNA沉默中的用途。


2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述CAMTA3基因或其活性片段如SEQIDNO:1所示序列；
任选地，所述CAMTA3基因或其活性片段编码如SEQIDNO:2所示氨基酸序列。


3.CAMTA3基因或其活性片段在植物抗病毒领域中的用途。


4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述CAMTA3基因或其活性片段如SEQIDNO:1所示；
任选地，所述CAMTA3基因或其活性片段编码如SEQIDNO:2所示氨基酸序列。


5.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，包括：
使得目标植物体内CAMTA3基因或其活性片段的表达水平与所述目标植物的野生型表现出差异，以便获得所述转基因植物。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括：
使得目标植物体内过表达所述CAMTA3基因或其活性片段；
任选地，将CAMTA3基因或其活性片段导入到目标植物体内，使得目标植物体内过表达所述CAMTA3基因或其活性片段；任选地，所述CAMTA3基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉乐，王韵婧，龚骞，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11