一种稳定性提高的蔗糖异构酶突变体及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种稳定性提高的蔗糖异构酶突变体及其构建方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明专利技术在高酶活分散泛菌来源蔗糖异构酶的基础上，筛选获得两株单点热稳定性提高的突变菌株V280L，S499F以及一株组合突变体V280L/S499L。三株突变体在热稳定显著提高的同时，酶的活性不受影响。本发明专利技术中的这些突变体比天然蔗糖异构酶更适用于工业生产，具有非常巨大的应用前景和产业价值。

【技术实现步骤摘要】
一种稳定性提高的蔗糖异构酶突变体及其构建方法
本专利技术涉及一种稳定性提高的蔗糖异构酶突变体及其构建方法技术，属于基因工程和酶工程

技术介绍
蔗糖异构酶(EC5.4.99.11)，又被称为异麦芽酮糖合成酶，蔗糖变位酶，属于α-淀粉酶13家族，是一种工业应用价值极高的异构酶，可以高效异构蔗糖生成异麦芽酮糖和海藻酮糖，异麦芽酮糖是近年来新兴的一种功能性甜味剂，是糖尿病患者最理想的蔗糖替代糖，在食品、医药等工业中具有广阔的应用前景，而蔗糖异构酶是目前生物酶法工业化生产异麦芽酮糖最有效的酶。目前已报道的蔗糖异构酶在生物催化过程中显示出有限的热稳定性，如来源于克雷伯氏菌sp.LX3的蔗糖异构酶，在50℃下的半衰期仅有1.8min，来源于肺炎克雷伯菌的蔗糖异构酶在50℃孵育20min后失去其40％的活性，大黄欧文菌来源的蔗糖异构酶在30℃保存24h后活性完全失去活性。然而，大多数研究只是通过固定化酶或细胞表面展示来提高酶的热稳定性，但它们的热稳定性在工业应用中仍然令人不甚满意。因此，对蔗糖异构酶进行分子修饰以提高其热稳定性的研究将是本专利技术的研究重点。
技术实现思路
为了解决目前蔗糖异构酶突变体热稳定性不高的问题，本专利技术提供了一种蔗糖异构酶突变体，是将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的蔗糖异构酶的第280位和/或第499位的氨基酸进行突变得到的。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述蔗糖异构酶的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体为：将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的蔗糖异构酶的第280位的缬氨酸突变为亮氨酸得到的，命名为：V280L，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体为：将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的蔗糖异构酶的第499位的丝氨酸突变为苯丙氨酸得到的，命名为：S499F，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体为：将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的蔗糖异构酶的第280位缬氨酸突变为亮氨酸，同时将第499位的丝氨酸突变为苯丙氨酸得到的，命名为：V280L/S499F，其氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术提供了一种制备上述突变体的方法，所述方法具体步骤如下：(1)以SEQIDNO.2所示核苷酸序列为模板，根据理性设计的位点，设计定点突变引物，进行PCR扩增获得含有突变位点的基因，然后构建含有编码突变体基因的载体。(2)将含有编码突变体的基因载体转化到宿主细胞内。(3)对上一步构建的重组细胞进行筛选验证，获得阳性克隆，然后通过培养发酵产酶，离心收集细胞，利用超声波细胞破碎仪破碎细胞，离心获得含有蔗糖异构酶突变体的粗酶液。本专利技术还提供了一种编码上述蔗糖异构酶突变体的基因。本专利技术还提供了一种携带上述基因的重组载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组载体以pXMJ19载体、pMA5载体、pHT43载体、pET-20b(+)载体和pDXW-10载体中的任一种作为表达载体。本专利技术还提供了一种携带上述基因，或上述重组载体的重组细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞以大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、酵母菌(Saccharomyces)中的任一种为表达宿主。本专利技术还提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主，表达了上述蔗糖异构酶突变体。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以pXMJ19载体、pMA5载体、pHT43载体、pET-20b(+)载体和pDXW-10载体中的任意一种为表达宿主。本专利技术还提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌以谷氨酸棒杆菌为宿主，表达了上述蔗糖异构酶突变体。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以谷氨酸棒杆菌ATCC13012为表达宿主。本专利技术提供了一种提高蔗糖异构酶热稳定性的方法，所述方法为，将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的蔗糖异构酶的第280位和/或第499位的氨基酸进行突变。本专利技术还提供了上述重组载体，或者上述重组细胞在制备蔗糖异构酶中的应用。本专利技术还提供了上述蔗糖异构酶突变体，或编码上述突变体的基因，或上述重组载体，或上述重组细胞在转化蔗糖生产异麦芽酮糖中的应用。有益效果(1)本专利技术在天然蔗糖异构酶的基础上，通过理性设计，结合定点突变生物技术改造蔗糖异构酶分子结构，分析了突变后残基对酶热稳定性的影响，并最终获得了两株单点突变稳定性提高的突变菌株V280L，S499F以及组合突变株V280L/S499F。(2)天然蔗糖异构酶的半衰期为11.2min，本专利技术提供的蔗糖异构酶突变体V280L在45℃时半衰期达到25.4min，是天然蔗糖异构酶的半衰期的2.26倍；蔗糖异构酶突变体S499F在45℃时半衰期达到21.5min，是天然蔗糖异构酶的半衰期的1.92倍；V280L/S499F在45℃时半衰期达到100min，是天然蔗糖异构酶的半衰期的8.9倍。(3)本专利技术提供的蔗糖异构酶突变体在热稳定显著提高的同时酶的活性不受影响。其中，突变体V280L和S499F在酶催化活性基本不变的情况下在45℃热处理20min后，突变体V280L和S499F以及组合突变体V280L/S499F分别保留49.1％，43.2％和93.3％的相对酶活，对照组则仅仅保留15.7％的相对酶活。(4)本专利技术所得的蔗糖异构酶突变体比野生型更适合于催化蔗糖生成异麦芽酮糖的应用，更利于生产工艺的灵活性。附图说明图1：野生型蔗糖异构酶及蔗糖异构酶突变体纯酶液的SDS-PAGE分析；其中：M，proteinmaker；1，野生型pdsi纯酶液；2-12分别为：含有E76R，A100E，G152P，I205M，V280L，S328F，S499F，S563R，S563L，N578M，V280L/S499F纯酶液。图2：45℃，pH6.0条件下孵育20min后野生型蔗糖异构酶及其突变体的残留活性。图3：45℃条件下野生型蔗糖异构酶及蔗糖异构酶突变体V280L，S499F，V280L/S499F的半衰期。图4：pH对野生型蔗糖异构酶及蔗糖异构酶突变体V280L，S499F，V280L/S499F酶活的影响。图5：温度对野生型蔗糖异构酶及蔗糖异构酶突变体V280L，S499F，V280L/S499F酶活的影响。具体实施方式下述实施例中所涉及的pXMJ19载体购自Invitrogen；下述实施例中所涉及的BHI液体培养基：购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。下述实施例中所涉及的培养基如下：LB液体培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蔗糖异构酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖异构酶的第280位和/或第499位的氨基酸进行突变得到的。/n

【技术特征摘要】
1.一种蔗糖异构酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的蔗糖异构酶的第280位和/或第499位的氨基酸进行突变得到的。


2.如权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体，其特征在于，所述突变体是：
将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的蔗糖异构酶的第280位的缬氨酸突变为亮氨酸得到的；
或将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的蔗糖异构酶的第499位的丝氨酸突变为苯丙氨酸得到的；
或将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的蔗糖异构酶的第280位缬氨酸突变为亮氨酸，同时将第499位的丝氨酸突变为苯丙氨酸得到的。


3.编码权利要求1或2所述的蔗糖异构酶突变体的基因。


4.携带权利要求3所述基因的重组载体。


5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，以pXMJ19载体、pMA5载体、pHT43载体、pET-20b(+)载体和pDXW-10载体中的任一种作...

【专利技术属性】
技术研发人员：张显，胡孟凯，唐梓桐，饶志明，王一迈，蔡超凡，卢杨，徐美娟，杨套伟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32