邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种邻苯二酚1，2‑双加氧酶突变体及其应用，通过定向突变得到了2个突变酶CatA

【技术实现步骤摘要】
邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体及其应用
本专利技术属于基因工程领域及酶工程领域，具体涉及邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体及其应用。
技术介绍
粘康酸，又称己二烯二酸，是一种不饱和二元羧酸。在有机合成工业中，粘康酸可以作为树脂、医药、食品和农药的基础原料。因为粘康酸有立体定向构型、活性二元羧酸基团和共轭双键，所以粘康酸可以发生很多反应，被认为是一种很有价值的中间体，可用于生产各种化学品。在日常生活中，顺，顺-粘康酸常用于生产尼龙原材料己二酸。但是由于高分子主链具备一定的规整性，尼龙大多数呈现白色半透明外观，透明性不好限制了其在某些方面的使用，通过引入含侧基或环结构的单体，破坏分子链规整性，可得到透明尼龙。因此，开发能够高效催化合成含侧基的顺，顺-粘康酸的邻苯二酚1,2-双加氧酶(CatA)具有重要的意义，其中底物含侧基的儿茶酚(如4-乙基儿茶酚和4-丙基儿茶酚)可从廉价、可再生的生物质资源中获得，从而使得工艺流程具有满足绿色工业的发展需求的潜能。定点突变作为分子改造的一种有效方式，被广泛应用于改善酶性质以及提高工业酶制剂的催化效率等方面。在前期研究中，已获得的野生型CatA(专利申请公布号：CN111254151A)与其他来源的重组邻苯二酚1,2-双加氧酶相比，在4位取代顺，顺-粘康酸的制备中具有一定优势。为了进一步提高CatA对底物含侧基的儿茶酚的催化活力，本专利技术通过定点突变对野生型CatA中位于底物口袋周围的氨基酸残基进行分子改造，得到催化效率有所提高的突变体CatAV90A和CatAI206V，提高了CatA在制备4位取代顺，顺-粘康酸上的应用潜力。
技术实现思路
专利技术目的：针对目前酶法合成4位取代粘康酸的工艺中存在的酶活性低、底物口袋小、产物得率低等问题，本专利技术提供了一种催化活性较高、底物口袋较大的邻苯二酚1，2-双加氧酶突变体。本专利技术还要解决的技术问题在于提供表达所述邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体的基因及其重组载体和重组表达转化体。本专利技术同时还要解决的问题在于提供一种所述邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体的制备方法和所述邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体在制备4位取代粘康酸中的应用。为实现上述目的，本专利技术提出了一种邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体，所述邻苯二酚1，2-双加氧酶突变体是以野生型邻苯二酚1，2-双加氧酶序列为基础，将其第90位缬氨酸残基替换为丙氨酸(CatAV90A)或将第206位异亮氨酸残基替换为缬氨酸(CatAI206V)后得到。在野生型CatA氨基酸序列的基础上对第90位缬氨酸残基和第206位异亮氨酸残基进行替换后，仍具有邻苯二酚1,2-双加氧酶的活性，在此基础上获得了底物口袋扩大的突变体，其中，野生型邻苯二酚1，2-双加氧酶氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其详细信息披露于专利CN111254151A中。本专利技术进一步提出了编码权利要求1所述的邻苯二酚1，2-双加氧酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示，其氨基酸列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示。进一步地，本专利技术提出了包含上述基因的重组载体，所述重组表达载体可以通过本领域常规方法将所述邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体核酸连接于各种表达载体上构建而成，所述表达载体为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，更优选质粒pET28a。所述邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体核酸可以操作性地连接于所选载体中合适表达的调控序列的下游，以实现所述邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体的组成型或诱导型表达。较佳的，可以通过下述方法制得本专利技术所述的重组突变表达载体：利用DNA定点突变技术获得含有所述邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体核酸序列的重组载体pET28a-ArcatAV90A，其核酸序列如SEQIDNO.2所示，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，重组载体pET28a-ArcatAI206V其核酸序列如SEQIDNO.3所示，其氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术同时提出了一种重组菌，通过将上述的重组载体转化至宿主微生物中得到。本专利技术所述的重组表达转化体可以通过本领域常规方法将所述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足所述重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体基因可被有效表达即可。优选的，所述重组菌的宿主菌为EscherichiacoliBL21(DE3)。上述重组菌的构建方法包括如下步骤：将重组突变载体pET28a-ArcatAV90A和pET28a-ArcatAI206V通过热击法转化至E.coliBL21(DE3)中，分别得到重组菌E.coliBL21(DE3)(pET28a-ArcatAV90A)和E.coliBL21(DE3)(pET28a-ArcatAI206V)。本专利技术进一步提出了上述重组菌在制备邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体中的应用。本专利技术所述突变酶通过对所述转化体进行培养后分离得到的。所述培养的方法和条件为本领域常规的方法和条件，可以根据宿主类型和培养方法等因素进行适当的选择，只要所述重组表达转化体能够生长并产生所述突变酶即可。所述培养所用的培养基为本领域任何可使所述转化体生长并产生所述突变酶的培养基，较佳的为LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0，较佳的，所述培养包括如下步骤：(i)将重组菌活化后得到的种子液接种到培养基中，培养至OD600nm为0.6-0.8时，加入IPTG，IPTG的终浓度为0.05-1.0mM(优选0.1mM)，诱导表达后，离心收集菌泥；(ii)将上述收集的菌泥用100mMTris-HCl(pH7.5)清洗两遍，然后加入10mL的100mMTris-HCl(pH7.5)重悬，超声破碎，离心得到的上清即为粗酶液。进一步地，本专利技术提出了上述重组菌在合成4位取代顺,顺-粘康酸中的应用，所述的4位取代顺,顺-粘康酸优选为4-乙基粘康酸和4-丙基粘康酸。具体地，包括如下步骤：(1)将重组菌种子液接种到培养基中，培养至OD600nm为0.6-0.8时，加入IPTG，IPTG的终浓度为0.05-1.0mM，优选0.1mM，诱导表达后，离心收集菌泥；(2)酶催化：将步骤(1)得到的菌泥进行超声破碎，离心，得到含邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体的粗酶液；向Tris-HCl缓冲液中添加粗酶液和4位取代儿茶酚，建立酶催化反应体系，进行酶催化反应，生成相应4位取代顺,顺-粘康酸。其中，步骤(1)中，重组菌活化后得到的种子液的制备方法为将重组菌接种到含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，即得。步骤(1)中，将重组菌种子液按照1％的体积比接种到LB液体培养基中。步骤(1)中，所述的诱导表达为在20℃，150rpm诱导表达2-10h，优选8h。步骤(2)中，所述的Tris-HCl缓冲液中Tr本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种邻苯二酚1，2-双加氧酶突变体，其特征在于，所述邻苯二酚1，2-双加氧酶突变体是以序列SEQ ID NO.1所示的野生型邻苯二酚1，2-双加氧酶序列为基础，将其第90位缬氨酸残基替换为丙氨酸或将第206位异亮氨酸残基替换为缬氨酸后得到。/n

【技术特征摘要】
1.一种邻苯二酚1，2-双加氧酶突变体，其特征在于，所述邻苯二酚1，2-双加氧酶突变体是以序列SEQIDNO.1所示的野生型邻苯二酚1，2-双加氧酶序列为基础，将其第90位缬氨酸残基替换为丙氨酸或将第206位异亮氨酸残基替换为缬氨酸后得到。


2.编码权利要求1所述的邻苯二酚1，2-双加氧酶突变体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示，其氨基酸列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。


3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因。


4.一种重组菌，其特征在于，通过将权利要求3所述的重组载体转化至宿主微生物中得到。


5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主菌为EscherichiacoliBL21(DE3)。


6.权利要求4所述的重组菌在制备邻苯二酚1,2-双加氧酶突变体中的应用。

【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，冷静，牛欢青，林康，胡瑞佳，朱晨杰，陈勇，柳东，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32