一种提升两歧双歧杆菌增殖效率的肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种提升两歧双歧杆菌增殖效率的肽及其应用，属于微生物技术领域。本发明专利技术为解决因氮源利用率低影响两歧双歧杆菌增殖的问题，提供了一种可提升两歧双歧杆菌增殖效率的方法，该方法以富含脯氨酸的分子量为200～1000Da的具有高亲水性的肽作为培养基的氮源培养两歧双歧杆菌。利用该方法培养两歧双歧杆菌，4g/L氮源浓度下发酵液OD

【技术实现步骤摘要】
一种提升两歧双歧杆菌增殖效率的肽及其应用
本专利技术涉及一种提升两歧双歧杆菌增殖效率的肽及其应用，本专利技术属于微生物

技术介绍
两歧双歧杆菌在身体肠内发醇后可产生乳酸菌和冰醋酸，能提升钙、磷、铁的使用率，推动铁和维他命D的消化吸收。两歧双歧杆菌发醇乳清蛋白产生的的的的半乳糖，是组成中枢神经系统中脑苷脂的成份，与婴儿出生后脑勺的快速生长发育有密切相关。两歧双歧杆菌能够合成维生素b21、B2、B6、B12及丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和苏氨酸等身体必不可少的营养元素，针对身体具备不可忽视的关键营养成分功效。鉴于其具有上述有效的益生功能，两歧双歧杆菌也越来越成为人们研究、开发、生产的重点，也被逐渐应用到益生菌乳制品生产中。但是目前商业化应用的两歧双歧杆菌菌株种类较少，主要在于两歧双歧杆菌的制备非常困难，氮源是制约其有效增殖的关键因素之一。目前，国内外对于两歧双歧杆菌的培养优化，主要是通过单因素试验和正交试验筛选优质的氮源，主要包括酵母浸粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、鱼骨蛋白胨等多种氮源。但是，两歧双歧杆菌的耐渗透压能力不强，而这类方法确定的氮源的添加量往往是过量的，生长过程中，培养基中会残留大量未被利用的肽和氨基酸，利用效率低，不仅会提高发酵液的渗透压从而抑制菌株的增殖，也会造成氮源的浪费。基于上述一系列问题，研究两歧双歧杆菌选择性利用的氮源，寻找可有效促进两歧双歧杆菌增殖的肽显得尤为重要。因此，为了更好地将两歧双歧杆菌应用于商业化生产，亟需找到一种适用于两歧双歧杆菌高效增殖的肽，以降低企业生产经济并缩短两歧双歧杆菌的代时，提高两歧双歧杆菌活菌数的产量。
技术实现思路
本专利技术针对两歧双歧杆菌培养过程中因氮源利用率低影响两歧双歧杆菌增殖的问题，提供了一种分子肽在提升两歧双歧杆菌增值效率中的应用，所述分子肽为脯氨酸含量介于25％～28％、分子量介于200～1000Da的亲水性肽。在本专利技术的一种实施方式中，两歧双歧杆菌生长体系中还含有葡萄糖、无水乙酸钠、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、FeSO4、柠檬酸氢二铵、吐温、半胱氨酸盐酸盐、CaCl2、酵母浸出粉、胡萝卜汁。在本专利技术的一种实施方式中，所述分子肽作为培养体系中的氮源。本专利技术还提供了脯氨酸含量介于25％～28％、分子量介于200～1000Da的亲水性肽的制备方法，具体步骤如下：(1)将酪蛋白与水混匀后，加入蛋白酶，进行酶解，经灭酶处理后，沉淀未水解蛋白并离心收集蛋白酶解液，对蛋白酶解液真空冷冻干燥得到酪蛋白酶解物干粉；(2)将酪蛋白酶解物干粉溶于水后，用截流量为2000Da的滤膜进行超滤处理并收集滤液；(3)采用NAK-II大孔树脂对步骤(2)获得的滤液浓缩富集，最后采用纳滤膜收集分子量介于200～1000Da的组分，即得分子量为200～1000Da的肽。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中酪蛋白浓度为65～75g/L；酪蛋白酶解在恒温pH下进行，酶解温度为45～50℃，pH为6.5～7，酶解时间为0.5～1h；所述蛋白酶选用风味蛋白酶，添加量为3500～4000U/gpro。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中酪蛋白浓度为70g/L，酪蛋白酶解在恒温恒pH下进行，温度为50℃，pH为6.5，酶解时间为0.5h，所述蛋白酶选用风味蛋白酶，添加量为4000U/gpro。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)对于酶解完成的酪蛋白水解物，采用沸水浴10min进行灭酶处理，并将pH调整至4.6沉淀未水解物的蛋白，并8000r/min，15min离心取上清。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)对酪蛋白肽混合组分进行NAK-II大孔树脂分离时，洗脱液依次选用浓度为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80％(v/v)的乙醇，流速为1.5mL/min，检测波长为220nm。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)利用截流量为200Da和1000Da的纳滤膜收集分子量介于200～1000Da的组分。本专利技术还提供了一种培养基，所述培养基中的氮源为脯氨酸含量介于25％～28％、分子量介于200～1000Da的亲水性肽。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养基的成分还含有葡萄糖、无水乙酸钠、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、FeSO4、柠檬酸氢二铵、吐温、半胱氨酸盐酸盐、CaCl2、酵母浸出粉、胡萝卜汁。本专利技术还提供了一种提升两歧双歧杆菌氮源利用率的方法，所述方法用脯氨酸含量介于25％～28％、分子量介于200～1000Da的亲水性肽。在本专利技术的一种实施方式中，所述脯氨酸含量介于25％～28％、分子量介于200～1000Da的亲水性肽作为培养基的氮源。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养基的成分还含有葡萄糖、无水乙酸钠、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、FeSO4、柠檬酸氢二铵、吐温、半胱氨酸盐酸盐、CaCl2、酵母浸出粉、胡萝卜汁。在本专利技术的一种实施方式中，测定不同氮源对两歧双歧杆菌的增殖效果时，氮源的添加量为4g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述的两歧双歧杆菌菌液的制备方法是通过将两歧双歧杆菌接种至培养基中进行培养，接种量为2％。在本专利技术的一种实施方式中，所述的两歧双歧杆菌最高生长量的测定是将两歧双歧杆菌接种至培养基中培养至对数期末期并测定OD600。在本专利技术的一种实施方式中，所述的两歧双歧杆菌包括两歧双歧杆菌CGMCCNO.13632、两歧双歧杆菌GDMCCNO:61198、两歧双歧杆菌GDMCCNO:60701。本专利技术还提供了上述提升两歧双歧杆菌氮源利用率的方法、脯氨酸含量介于25％～28％、分子量介于200～1000Da的亲水性肽的制备方法和上述培养基在培养两歧双歧杆菌中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种提升两歧双歧杆菌增殖效率的方法，是利用以脯氨酸含量介于25％～28％、分子量介于200～1000Da的亲水性肽为氮源的培养基培养两歧双歧杆菌。利用该方法培养两歧双歧杆菌时，4g/L氮源培养浓度下两歧双歧杆菌OD600高于1.6，显著高于其他氮源，为其他氮源的1.9～7倍；与其他氮源相比代时显著缩短，小于2.6h。本专利技术中，依据两歧双歧杆菌利用肽的分子量及结构特性，采用酶解、超滤、纳滤以及NAK-II大孔树脂分离技术，依次对肽组分进行区分浓缩，获得了适宜两歧双歧杆菌高效增殖的肽，以所述肽为氮源的培养基培养两歧双歧杆菌，氮源利用率达30％以上，其他氮源的利用率仅在10％以下，有效提高了氮源的利用效率，有效减少氮源的浪费。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步的阐述。下述实施例中涉及的酪蛋白购自于创赛生物科技有限公司；下述实施例中涉及的风味蛋白酶购自于江苏博美达科技有限公司；下述实施例中涉及的酵母浸粉FM888本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分子肽在提升两歧双歧杆菌增殖效率中的应用，其特征在于，所述分子肽为脯氨酸含量介于25％～28％、分子量介于200～1000Da的亲水性肽。/n

【技术特征摘要】
1.分子肽在提升两歧双歧杆菌增殖效率中的应用，其特征在于，所述分子肽为脯氨酸含量介于25％～28％、分子量介于200～1000Da的亲水性肽。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，两歧双歧杆菌生长体系中还含有葡萄糖、无水乙酸钠、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、FeSO4、柠檬酸氢二铵、吐温、半胱氨酸盐酸盐、CaCl2、酵母浸出粉、胡萝卜汁。


3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述分子肽作为培养体系中的氮源。


4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述脯氨酸含量介于25％～28％、分子量介于200～1000Da的亲水性肽的制备方法如下：
(1)将酪蛋白与水混匀后，加入蛋白酶，进行酶解，经灭酶处理后，沉淀未水解蛋白并离心收集蛋白酶解液，对蛋白酶解液真空冷冻干燥得到酪蛋白酶解物干粉；
(2)将酪蛋白酶解物干粉溶于水后，用截流量为2000Da的滤膜进行超滤处理并收集滤液；
(3)采用NAK-II大孔树脂对步骤(2)获得的滤液浓缩富集，最后采用纳滤膜收集分子量介于200～1000Da的组分，即得分子量为200～1000Da的肽。

【专利技术属性】
技术研发人员：崔树茂，汪文丽，毛丙永，唐鑫，赵建新，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32