一种厌氧微生物的纯培养方法技术

本发明专利技术公开了一种厌氧微生物的纯培养方法。包括以下步骤：步骤1：配制液体培养液，煮沸，滴加刃天青，分装至细口管中，得到培养管；步骤2：通入N

【技术实现步骤摘要】
一种厌氧微生物的纯培养方法
本专利技术涉及生物工程
，具体为一种厌氧微生物的纯培养方法。
技术介绍
常见的厌氧微生物培养过程中，有发酵方式、多种微生物共培养方式，但都会存在分离问题。而纯培养方式中，一般使用厌氧培养箱或厌氧培养罐来培养厌氧微生物，但该方式操作较复杂，较适合固体培养基培养，不适合液体培养基培养。目前，常见的液体培养基中，会预先加入还原剂如半胱氨酸、抗坏血酸等，来降低氧化还原电位，隔绝氧气，从而形成厌氧环境，进行培养微生物。但是该方法，加入的还原剂量过多，溶解性较大，存在被微生物食用，影响厌氧微生物的生长；同时，该还原剂不易与微生物分离回收，影响最终微生物菌液的纯度，造成培养废液污染。综上，解决上述问题，制备一种可分离回收的抗氧化剂，用于降低氧化还原电位，形成一种厌氧微生物的纯培养方法具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种厌氧微生物的纯培养方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：一种厌氧微生物的纯培养方法，包括以下步骤：步骤1：配制液体培养液，水浴加热，滴加NaOH调节pH；煮沸，滴加刃天青，分装至细口管中，得到培养管；步骤2：将曝气针插入培养管，通入N2/H2混合气体，曝气，迅速盖紧橡胶塞；步骤3：将培养管置于高压灭菌锅内，高温灭菌；冷却，放入恒温培养箱中；转移至超净台中紫外灭菌；步骤4：使用注射器将磁性抗氧化剂注入至培养管中，混匀；使用注射器将厌氧微生物种子液注入培养管中，放入恒温培养箱中培养，得到厌氧微生物群。较为优化地，所述厌氧微生物为产乙酸嗜蛋白菌时，步骤1中，每升液体培养液中包括以下成分：5g多聚蛋白胨、5g胰蛋白胨、10g酵母浸膏、10g葡萄糖、0.96L蒸馏水、40mL微量元素原液；每升微量元素原液中包括以下成分：0.2gCaCl2、0.4gMgSO4·7H2O、1.0gK2HPO4、1.0gKH2PO4、10.0gNaHCO3、2.0gNaCl、1L蒸馏水。较为优化地，所述厌氧微生物为硫还原地杆菌时，步骤1中，每升液体培养液中包括以下成分：1.5gNH4Cl、0.6gNa2HPO4、0.1gKCl、0.82gCH3COONa、2.5gNaHCO3、8.0g富马酸二钠、10mL微量元素原液；10mL维生素液；每升微量元素原液中包括以下成分：1.5g氨三乙酸、3.0gMgSO4·7H2O、0.5gMnSO4·H2O、1.0gNaCl、0.1gFeSO4·7H2O、0.1gCoCl2·6H2O、0.76gCaCl2、0.1gZnSO4·7H2O、0.01gCuSO4·5H2O、0.02gKAl(SO4)2·12H2O、0.01gH3BO3、0.01gNa2MoO4·12H2O；每升维生素液中包括以下成分：2mg生物素、2mg叶酸、10mg维生素B6盐酸盐、5mg盐酸硫胺素、5mg核黄素、5mg维生素B3、5mgD-泛酸钙、0.1mg维生素B12、5mg对氨基苯甲酸、5mg硫辛酸。较为优化地，步骤1中，所述NaOH的浓度为1mol/L；所述pH＝7.1～7.5；所述刃天青加入的浓度为0.1mg/L。较为优化地，步骤2中，N2/H2混合气体是质量比为80％N2/20％H2的混合气体；曝气时间为20～30分钟。较为优化地，步骤3中，高温灭菌的温度为121℃，时间为15～25分钟；紫外灭菌的时间为20～30分钟。较为优化地，步骤4中，所述厌氧微生物种子液的注入量为2～5％，培养温度为37℃，培养时间为5～7天。较为优化地，步骤4中，所述磁性抗氧化剂是以抗坏血酸/磁性离子液体为核心，以抗坏血酸棕榈酸脂为外壳的水凝胶。较为优化地，步骤4中，所述磁性抗氧化剂的加入量为葡萄糖质量的30％～40％。较为优化地，步骤4中，所述磁性抗氧化剂的具体制备方法为：(1)抗坏血酸/磁性离子液体：氮气氛围下，将三辛基甲基氯化铵溶于甲醇；加入四水合氯化锰溶液，室温搅拌22～26小时；旋转蒸发，使用蒸馏水洗涤，减压干燥12～20小时；将其溶于乙醇中，加入磷酸缓冲溶液，加入抗坏血酸水溶液，混合搅拌15～20分钟，浓缩，得到抗坏血酸/磁性离子液体；(2)磁性抗氧化剂的制备：氮气氛围下，将抗坏血酸棕榈酸脂溶解在二氯亚砜中，加热至40～50℃搅拌15～20分钟，得到5～6wt％的溶液A，将抗坏血酸/磁性离子液体加水稀释，加热至35～45℃，得到10～12wt％的溶液B，将溶液B在快速搅拌中滴加到溶液A中，得到磁性抗氧化剂。本技术方案中，加入刃天青作为氧化还原指示剂(刃天青未活化是为蓝色，活化后还原为粉色，最终变成无色)；采用曝气基本全部去除氧气，再加入较少的磁性抗氧化剂，去除痕量活性氧，保证绝对厌氧环境，同时，防止漏气情况出现，维持培养过程中营养物质的稳定性。将四水合氯化锰与三辛基甲基氯化铵合成了锰酸盐阴离子磁性离子液体，利用该液体萃取抗坏血酸，浓缩得到抗坏血酸/磁性离子液体，以此为核心，再利用抗坏血酸与抗坏血酸棕榈酸脂的氢键作用包封形成水凝胶。其中，抗坏血酸棕榈酸脂为常用的抗氧化剂，可以增加液体培养液的稳定性，且其为脂溶性物质，不易被水溶解，从而不易被厌氧微生物食用；而以抗坏血酸/磁性离子液体为核心，同样的抗坏血酸具有抗氧化性，被包封在内部，辅助抗坏血酸棕榈酸脂抗氧化，而磁性离子液体包封在内部是为了可以将磁性抗氧化剂与菌液分离。与现有技术相比，本专利技术所达到的有益效果是：(1)本专利技术无需利用厌氧培养箱，操作简单便利；(2)本专利技术中磁性抗氧化剂不溶于液体培养液，不易被厌氧微生物吸收，不影响生长，且可以通过磁性分离，从而简化厌氧微生物的分离，得到较纯的厌氧微生物群，同时该物质可。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1是实施例1中硫还原地杆菌生长曲线图；图2是实施例2中乙酸嗜蛋白菌生长曲线图。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施1：以培养硫还原地杆菌为例液体培养液成分：所述每升液体培养液中包括以下成分：1.5gNH4Cl、0.6gNa2HPO4、0.1gKCl、0.82gCH3COONa、2.5gNaHCO3、8.0g富马酸二钠、10mL微量元素原液；10mL维生素液；所述每升微量元素原液中包括以下成分：1.5g氨三乙酸、3.0gMgSO4·7H2O、0.5gMnSO4·H2O、1.0gNaCl、0.1gFeSO4·7H2O、0.1gCoCl2·6H2O、0.76gCaCl2、0.1gZnSO4·7H2O、0.01gCuSO4·5H2O、0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种厌氧微生物的纯培养方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤1：配制液体培养液，水浴加热，滴加NaOH调节pH；煮沸，滴加刃天青，分装至细口管中，得到培养管；/n步骤2：将曝气针插入培养管，通入N

【技术特征摘要】
1.一种厌氧微生物的纯培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：配制液体培养液，水浴加热，滴加NaOH调节pH；煮沸，滴加刃天青，分装至细口管中，得到培养管；
步骤2：将曝气针插入培养管，通入N2/H2混合气体，曝气，迅速盖紧橡胶塞；
步骤3：将培养管置于高压灭菌锅内，高温灭菌；冷却，放入恒温培养箱中；转移至超净台中紫外灭菌；
步骤4：使用注射器将磁性抗氧化剂注入至培养管中，混匀；使用注射器将厌氧微生物种子液注入培养管中，放入恒温培养箱中培养，得到厌氧微生物群。


2.根据权利要求1所述的一种厌氧微生物的纯培养方法，其特征在于：所述厌氧微生物为产乙酸嗜蛋白菌时，步骤1中，每升液体培养液中包括以下成分：5g多聚蛋白胨、5g胰蛋白胨、10g酵母浸膏、10g葡萄糖、0.96L蒸馏水、40mL微量元素原液；每升微量元素原液中包括以下成分：0.2gCaCl2、0.4gMgSO4·7H2O、1.0gK2HPO4、1.0gKH2PO4、10.0gNaHCO3、2.0gNaCl、1L蒸馏水。


3.根据权利要求1所述的一种厌氧微生物的纯培养方法，其特征在于：所述厌氧微生物为硫还原地杆菌时，步骤1中，每升液体培养液中包括以下成分：1.5gNH4Cl、0.6gNa2HPO4、0.1gKCl、0.82gCH3COONa、2.5gNaHCO3、8.0g富马酸二钠、10mL微量元素原液；10mL维生素液；每升微量元素原液中包括以下成分：1.5g氨三乙酸、3.0gMgSO4·7H2O、0.5gMnSO4·H2O、1.0gNaCl、0.1gFeSO4·7H2O、0.1gCoCl2·6H2O、0.76gCaCl2、0.1gZnSO4·7H2O、0.01gCuSO4·5H2O、0.02gKAl(SO4)2·12H2O、0.01gH3BO3、0.01gNa2MoO4·12H2O；每升维生素液中包括以下成分：2mg生物素、2mg叶酸、10mg维生素B6盐酸盐、5mg盐酸硫胺素、5mg核黄素、5mg维生素B3、5mgD-泛酸钙、0.1mg维生素B12...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭膘虎，刘倩，林辉，吕斯濠，文震，
申请(专利权)人：东莞理工学院，
类型：发明
国别省市：广东;44