一种高免疫原性的多肽二价抗原蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种高免疫原性的多肽二价抗原蛋白及其制备方法和应用。本发明专利技术通过将两个相同的抗原肽X通过连接肽尾首连接获得的二价重组抗原蛋白；其中，所述抗原肽X为包含抗原表位的短肽，所述短肽由6‑15个氨基酸组成；所述连接肽为(AP)nA，连接方式为X‑(AP)nA‑X，其中，n＝3、4、5、6或7。试验证明，本申请提供的多肽二价抗原蛋白免疫原性显著增强，无需偶联载体蛋白即可刺激动物体产生针对多肽的特异性抗体，这说明二价抗原在B细胞的激活过程中是必要的，为快速制备6×His‑Tag的单克隆抗体及类似多肽的单克隆抗体及短肽相关序列的免疫评价奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种高免疫原性的多肽二价抗原蛋白及其制备方法和应用
本专利技术属于免疫学
，具体涉及一种高免疫原性的多肽二价抗原蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
组氨酸标签(His-tag)，由六个His残基组成(HHHHHH)，其分子量小，基本对目的蛋白本身特性几乎没有影响，不会改变目的蛋白本身的可溶性和生物学功能，在融合蛋白结晶后对蛋白的结构没有影响；His-Tag的免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体；更重要的是它使蛋白质的纯化变得极为方便，根据组氨酸上的咪唑环可以与二价金属离子结合的原理，人们可以利用金属离子亲和层析技术纯化带有His标签的蛋白。因此，His-tag是最常用的一种蛋白表达标签，插入在目的蛋白的C末端或N末端均可，另外该标签也可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签使用，便于目的蛋白的纯化和检测。因为His-Tag的免疫原性相对较低，以实验小鼠为宿主制备的His标签单抗的通常制备方法是：人工合成6*His多肽，必要时在末端添加偶联载体用到的特殊氨基酸。合成好此多肽后，通过化学方法将此多肽与载体蛋白偶联(如KLH、BSA、OVA等)，偶联完成后，再用偶联好的全抗原免疫实验小鼠，免疫结束后杀死免疫好的小鼠，无菌条件下取脾脏，与骨髓瘤细胞进行融合，用ELISA或者其它手段进行筛选出阳性的克隆，筛选到的细胞经过克隆化后即形成稳定的细胞株，将此细胞株进行体外培养或小鼠体内诱生腹水形成，再从培养基或者腹水中纯化即可得到His标签鼠单抗。该方法操作复杂，而且由于引入外源载体蛋白，为筛选到特异性针对His-Tag的单克隆抗体带来较大困难。目前，表位肽的研究已经在疫苗相关
得到广泛应用，但其仍存在免疫原性低的缺陷；此外，其他短肽，如从7肽库、12肽库随机筛选到的7肽或12肽等，也因为免疫原性相对较低而很难刺激机体产生免疫应答，通常研究者也是通过化学方法将此类多肽与载体蛋白偶联(如KLH、BSA、OVA等)，偶联完成后，再用偶联好的全抗原免疫实验小鼠，这一过程相对繁琐，为短肽类物质的免疫评价及单克隆抗体制备带来一定困难。因此，如何更高效便捷的获得具备高免疫原性的抗原蛋白是急需解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高免疫原性的多肽二价抗原蛋白。本专利技术的第二个目的在于提供上述高免疫原性的多肽二价抗原蛋白的制备方法。本专利技术的第三个目的在于提供上述述高免疫原性的多肽二价抗原蛋白的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种高免疫原性的多肽二价抗原蛋白，将两个相同的抗原肽X通过连接肽尾首连接获得的二价重组抗原蛋白；所述抗原肽X为包含抗原表位的短肽，所述短肽由6-15个氨基酸组成；所述连接肽为(AP)nA，连接方式为X-(AP)nA-X，其中，n＝3、4、5、6或7。优选的，所述抗原肽X的氨基酸序列为HHHHHH。优选的，所述抗原肽X包含PCV3Cap蛋白抗原表位140KHSRYFT146，其氨基酸序列为KHSRYFT；所述连接肽为(AP)5A，连接方式为KHSRYFT-(AP)5A-KHSRYFT。优选的，所述抗原肽X包含PCV3Cap蛋白抗原表位140KHSRYFT146，其氨基酸序列为TSKKKHSRYFTPKPI；所述连接肽为(AP)5A，连接方式为TSKKKHSRYFTPKPI-(AP)5A-TSKKKHSRYFTPKPI。一种高免疫原性的多肽二价抗原蛋白的制备方法，将两个相同的抗原肽X通过连接肽尾首相连，获得高免疫原性的多肽二价抗原蛋白；所述抗原肽X为包含抗原表位的短肽，所述短肽由6-15个氨基酸组成；所述连接肽为(AP)nA，连接方式为X-(AP)nA-X，其中，n＝3、4、5、6或7。优选的，所述抗原肽X的氨基酸序列为HHHHHH。优选的，所述抗原肽X包含PCV3Cap蛋白抗原表位140KHSRYFT146，其氨基酸序列为KHSRYFT，所述连接肽为(AP)5A，连接方式为KHSRYFT-(AP)5A-KHSRYFT。优选的，所述抗原肽X包含PCV3Cap蛋白抗原表位140KHSRYFT146，其氨基酸序列为TSKKKHSRYFTPKPI，所述连接肽为(AP)5A，连接方式为TSKKKHSRYFTPKPI-(AP)5A-TSKKKHSRYFTPKPI。本专利技术还提供了上述的高免疫原性的多肽二价抗原蛋白在制备单克隆抗体或多克隆抗体中的应用；所述多肽二价抗原蛋白经弗氏佐剂乳化后直接免疫动物，能够刺激动物体产生针对多肽二价抗原蛋白的特异性抗体。本专利技术取得的有益效果：本专利技术提供的高免疫原性的多肽二价抗原蛋白及其制备方法。多肽二价抗原蛋白是将两个相同的抗原肽X通过连接肽尾首连接获得的二价重组抗原蛋白；其中，所述抗原肽X为包含抗原表位的短肽，所述短肽由6-15个氨基酸组成；所述连接肽为(AP)nA，连接方式为X-(AP)nA-X，其中，n＝3、4、5、6或7。试验证明，本申请提供的多肽二价抗原蛋白免疫原性显著增强，无需偶联载体蛋白即可刺激动物体产生针对多肽的特异性抗体，这说明二价抗原在B细胞的激活过程中是必要的，为快速制备6×His-Tag的单克隆抗体及类似多肽的单克隆抗体及短肽相关序列的免疫评价奠定基础。附图说明图1是多肽质谱(MS)鉴定结果1；图2是多肽质谱(MS)鉴定结果2；图3是高效液相色谱(HPLC)鉴定结果1；图4是高效液相色谱(HPLC)鉴定结果2；图5是二价抗原免疫机体后不同时间刺激机体产生抗体的水平；图6是二价抗原免疫后刺激机体产生抗体的差异；图7是Dot-ELISA鉴定。其中，图中A为His单抗鉴定结果：1为H6-(AP)5A-H6；2为KHSRYFT-(AP)5A-KHSRYFT；图中B为PCV3Cap蛋白单抗鉴定结果：1为KHSRYFT-(AP)5A-KHSRYFT；2为H6-(AP)5A-H6；图中C为PCV3Cap蛋白单抗鉴定结果：1为TSKKKHSRYFTPKPI-(AP)5A-TSKKKHSRYFTPKPI；2为H6-(AP)5A-H6。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此；本专利技术所使用的仪器设备如无特别说明，均为市售常规仪器设备；所用试剂材料，如无特别说明，均为市售常规试剂材料；重多肽合成等技术服务由上海生工生物工程有限公司提供。实施例1一、材料与方法1.1多肽合成所涉及多肽包括：(1)一条用以偶联卵清蛋白OVA的6×His-TagCH6，用以作为多肽免疫小鼠抗6×His-Tag效价评定的ELISA包被原。(2)一条以两个6×His-Tag直接串联的H6-H6；两条分别以一个6×His-Tag与刚性15肽linker(AP)7A的N或C端相连接的H6-(AP)7A、(AP)7A-H6；以及一条以两个6×His-Tag同时连接于刚性1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高免疫原性的多肽二价抗原蛋白，其特征在于，将两个相同的抗原肽X通过连接肽尾首连接获得的二价重组抗原蛋白；所述抗原肽X为包含抗原表位的短肽，所述短肽由6-15个氨基酸组成；所述连接肽为(AP)nA，连接方式为X-(AP)nA-X，其中，n＝3、4、5、6或7。/n

【技术特征摘要】
20200814 CN 20201081890171.一种高免疫原性的多肽二价抗原蛋白，其特征在于，将两个相同的抗原肽X通过连接肽尾首连接获得的二价重组抗原蛋白；所述抗原肽X为包含抗原表位的短肽，所述短肽由6-15个氨基酸组成；所述连接肽为(AP)nA，连接方式为X-(AP)nA-X，其中，n＝3、4、5、6或7。


2.根据权利要求1所述多肽二价抗原蛋白，其特征在于，所述抗原肽X的氨基酸序列为HHHHHH。


3.根据权利要求1所述的多肽二价抗原蛋白，其特征在于，所述抗原肽X包含PCV3Cap蛋白抗原表位140KHSRYFT146，其氨基酸序列为KHSRYFT；所述连接肽为(AP)5A，连接方式为KHSRYFT-(AP)5A-KHSRYFT。


4.根据权利要求1所述的多肽二价抗原蛋白，其特征在于，所述抗原肽X包含PCV3Cap蛋白抗原表位140KHSRYFT146，其氨基酸序列为TSKKKHSRYFTPKPI；所述连接肽为(AP)5A，连接方式为TSKKKHSRYFTPKPI-(AP)5A-TSKKKHSRYFTPKPI。


5.一种高免疫原性的多肽二价抗原蛋白的制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈玉梅，张龙现，史平玲，张磊，娄岳，王彦伟，田媛媛，
申请(专利权)人：河南中泽生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41