从植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂衍生的支架蛋白制造技术

本发明专利技术涉及源自植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂的支架蛋白以及编码它们的核酸。支架高度稳定并且具有展示肽的能力。支架尤其适于例如在噬菌体展示或相关的系统中构建文库。本发明专利技术也涉及支架的各种用途，包括在治疗、诊断、环境和安全性监测、合成生物学和研究中的用途，和涉及表达支架蛋白的细胞和细胞培养物。

【技术实现步骤摘要】
从植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂衍生的支架蛋白本申请是申请日为2014年2月14日，申请号为201480022070.5(PCT/GB2014/050435)，专利技术名称为“从植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂衍生的支架蛋白”的中国专利申请的分案申请。本专利技术涉及新的蛋白质、编码它们的核酸，并涉及使用它们的方法。尤其地，本专利技术涉及可用作展示肽序列的支架的蛋白质，并且涉及这些支架在比如治疗、诊断、环境和安全性监测、合成生物学和研究领域中的用途。
技术介绍
‘所谓的‘蛋白质支架的使用在生物化学中作为产生在研究和医药中使用的新配体结合蛋白质的潜在途径获得关注。用于展示一个或多个肽序列的这样的支架蛋白可潜在地提供抗体或抗体片段的可选方案。术语‘蛋白质支架‘用于描述在不同背景下观察到的并且具有不同生物化学功能的一类多肽结构。因为它们固有的构象稳定性，已经推论这样的支架可经得起蛋白质工程化。常规上认为免疫球蛋白(抗体)的功能归功于保守的框架区域和由高变肽区段形成的空间明确限定的抗原-结合位点的组成，这些区段的序列和构象都不同。在抗体工程化方法以及文库技术导致成功选择功能性抗体片段之后，使用其他蛋白质构造以合成有用的结合蛋白质的兴趣开始增加。对采用的适当的蛋白质支架的期望的特性的描述包括下述；“适当的蛋白质支架的候选物应展示紧凑和结构上刚性的核心，其能够呈现具有不同序列和长度的表面环，或能够以其他方式在连续表面区域——包括暴露的疏水性残基——中耐受侧链置换，，而不显著改变它们的折叠特性。”SkerraA:Engineeredproteinscaffoldsformolecularrecognition.JMolRecognit2000,13:167-187，并且术语‘支架‘，如在蛋白质工程化中使用的，描述了单链多肽框架，其通常具有减小的尺寸(<200AA)并且包含与允许插入、缺失或其他置换的、具有高构象耐受的可变部分相关的高度结构化的核心‘。Wurch等,TrendsinBiotechnology,2012年11月,30,575-582。但是，并不是初看似乎对于环区域工程化有吸引力的所有类型的多肽折叠事实上都允许构建具有高亲和力和特异性的独立的配体结合位点。现有技术支架包括失活的葡萄球菌核酸酶、绿色荧光蛋白(GFP)和硫氧还蛋白A(TrxA)、Ⅲ型纤连蛋白结构域('Fn3')、脂笼蛋白家族蛋白质，后胆色素结合蛋白(BBP)，以及分离的蛋白质折叠，比如葡萄球菌蛋白A的Z结构域、“亲合体(affibodies)”、anticafins和锚蛋白重复序列等。WO2006/131749描述了在StefinA中产生的数个合理突变，以改善其作为支架。修饰的StefinA支架包含在下述三个位点的突变Lys71-Leu73、V48D和G4W，并且被称为STM(StefinA三重突变体)。WO2009/136182描述了STM支架的进一步改进。仍需要改善的支架蛋白。尤其地，已经发现现有技术支架通常不能充分使肽适体稳定，并且支架中适体的存在实际上使得支架显著变形。见例如Woodman等，‘DesignandValidationofaNeutralProteinScaffoldforthePresentationofPeptideAptamers‘,J.Mol.Biol.(2005)352,1118–1133理想地，这样的改善的支架蛋白将提供一个或多个下述益处：-改善的稳定性，以提供不变形的刚性框架；-更小的尺寸；-支持高质量和复杂性文库的改善的能力；-选择的结合蛋白质对于它们靶的改善的亲和力；和-由于可用的N-和C-末端而对进一步操作的简化。
技术实现思路
根据本专利技术，提供了合成蛋白，其具有源自植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂或与植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂相关的序列。适当地，合成蛋白包含数个(例如10个或更多个、20个或更多个或50个或更多个)植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂蛋白质的共有序列。适当地，合成蛋白是支架蛋白，其包含被改造成或适于异源肽序列插入的位点。因此，本专利技术的支架蛋白优选地不基于单一天然存在的蛋白质序列，而是自然中不存在的新蛋白质，其通过细心设计植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂类的代表的共有序列获得。在一种实施方式中，合成蛋白包含氨基酸序列NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQVVAGTMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVKPWENFKELQEFKPVGDA(SEQIDNO1)，或其变体。优选地变体具有与其至少50％，更优选地70％同一性的序列。已经发现，包含这样的序列的合成蛋白提供非常稳定和有用的支架蛋白。在另一实施方式中，合成蛋白包含氨基酸序列GNENSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQVVAGTMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVKPWENFKELQEFKPVGDA(SEQIDNO2)，或其变体。优选地变体具有与其至少50％，更优选地70％同一性的序列。在另一实施方式中，合成蛋白包含氨基酸序列ATGVRAVPGNENSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQVVAGTMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVKPWENFKELQEFKPVGDA(SEQIDNO3)，或其变体。优选地变体具有与其至少50％，更优选地70％同一性的序列。更优选地，本专利技术的合成蛋白包含与上述SEQIDNOS1、2或3至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。一般更高水平的同一性是优选的。在一些情况下，合成蛋白包含与SEQIDNO1、2或3一致，或基本上一致的氨基酸序列，或由与SEQIDNO1、2或3一致，或基本上一致的氨基酸序列组成。在本专利技术优选的实施方式中，上面阐释的合成蛋白包含插入其中的至少一种异源肽序列。本专利技术的合成蛋白尤其用作用于约束和展示肽序列的支架蛋白。因此，本专利技术延伸至‘空‘支架蛋白(即不存在任何异源肽序列)和具有插入其中的一个或多个异源序列的支架蛋白。因此，本专利技术优选的实施方式是具有如本文所描述的序列的合成支架蛋白，所述支架蛋白展示在支架的适当点插入的一个或多个异源肽。‘展示‘意思是肽序列在使得肽在适当的条件下暴露于支架表面的位置被插入到支架蛋白中，所述适当的条件例如非变性条件，比如在体内或体外试验中。这样的展示一个或多个异源肽的支架蛋白通常称为肽适体或多个肽适体，但是应当注意，术语适体的使用多少与本领域不一致，指肽它们本身或完整的蛋白质。优选地，异源肽序列的长度是3至30个氨基酸，更优选地4至20个氨基酸，更优选地4至16个氨基酸。已经发现本专利技术的合成蛋白尤其适于展示长度是5至13个氨基酸的异源序列。优选地，异源肽序列被插入到合成蛋白的环区域中或蛋白质的N-末端。环区域可定义为这样的区域：其在常规的条件下不涉及蛋白质的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种合成蛋白，其包含下述序列：NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQ(Xn)TMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK(Xn)NFKELQEFKPVGDA(SEQ ID NO:4)，或其变体，其中所述变体包含由所述序列中一个或多个氨基酸的缺失、置换、插入、倒位或添加造成的氨基酸序列的变异，其中Xn是异源肽，其中X是任何氨基酸和n是氨基酸的数量，其中n是3至30，并且其中所述合成蛋白或其变体具有解链温度Tm为70℃或更高。/n

【技术特征摘要】
20130214 GB 1302597.81.一种合成蛋白，其包含下述序列：NSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQ(Xn)TMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVK(Xn)NFKELQEFKPVGDA(SEQIDNO:4)，或其变体，其中所述变体包含由所述序列中一个或多个氨基酸的缺失、置换、插入、倒位或添加造成的氨基酸序列的变异，其中Xn是异源肽，其中X是任何氨基酸和n是氨基酸的数量，其中n是3至30，并且其中所述合成蛋白或其变体具有解链温度Tm为70℃或更高。


2.权利要求1所述的合成蛋白，其中所述异源肽序列的长度是3至20个氨基酸。


3.权利要求2所述的合成蛋白，其中所述异源肽序列的长度是5至13个氨基酸。


4.前述权利要求中任一项的合成蛋白，其包含在N末端的另外的氨基酸序列，其中所述在N末端的另外的氨基酸序列包含序列MATGVRAVPGNE(SEQIDNO80)，或是另外的异源肽序列。


5.权利要求1所述的合成蛋白，其Tm为80℃或更高。


6.前述权利要求任一项所述的合成蛋白，其被连接至连接体或标签。


7.权利要求6所述的合成蛋白，其中所述连接体或标签连接于所述合成蛋白的C-末端或N-末端，或连接于所述合成蛋白的C-末端和N-末端二者。


8.权利要求1-5任一项所述的合成蛋白，其被连接至基底或部分，其中所述部分是标记、载体或蛋白。


9.权利要求8所述的合成蛋白，其中所述部分或基底连接于所述合成蛋白的C-末端或N-末端，或连接于所述合成蛋白的C-末端和N-末端二者。


10.包含根据权利要求1至5任一项所述合成蛋白的群体的文库。


11.权利要求10所述的文库，其复杂性为108或更高。


12.权利要求10所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·麦克弗森，D·汤姆林森，
申请(专利权)人：利兹大学，
类型：发明
国别省市：英国;GB