海洋短芽孢杆菌抗肿瘤活性多肽及其药物和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种由短芽孢杆菌Brevibacillus sp.N189产生的多肽PBN3，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2018662，所述多肽的分子量为759.44Da，所述多肽的氨基酸序列为Leu‑Thr‑Ala‑His‑Tyr‑Arg。本发明专利技术还公开了所述多肽的制药用途和包含该多肽的抗肺癌药物。

【技术实现步骤摘要】
海洋短芽孢杆菌抗肿瘤活性多肽及其药物和应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种海洋短芽孢杆菌抗肿瘤活性多肽及其药物和应用。
技术介绍
根据国际癌症研究机构(IARC)，对全球癌症负担进行了新的估计，显示到2020年，全球癌症病例已上升到1930万，癌症死亡人数为1000万。肺癌仍然是癌症死亡的主要原因。由于海洋面积大，海洋环境多样，对于海洋的开发正处于一个不断认知的过程，同时海洋中微生物的数量为106～109个/mL，在海洋中具有庞大的数量，且由于南极海洋存在低温等特殊环境条件，使得生存其中的微生物更容易代谢出新的代谢产物，也为生物医药的开发带来更多的可能。生物小分子活性物具有分子量小，易吸收，毒副作用小等优点，成为生物医药开发的热点。通过微生物发酵的方式，从海洋微生物的代谢产物中提取能够抑制肿瘤细胞增殖的天然小分子活性物，不断促进海洋活性物的开发和利用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种由新型短芽孢杆菌N189产生的抗肿瘤活性成分及其药物和用途。本专利技术首先提供了一种由短芽孢杆菌Brevibacillussp.N189产生的多肽PBN3，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2018662，所述多肽的分子量为759.44Da，所述多肽的氨基酸序列为Leu-Thr-Ala-His-Tyr-Arg(SEQIDNo.2)。本专利技术的第二方面是提供了上述多肽PBN3在制备预防或者治疗肿瘤的药物中的应用，所述肿瘤选自肺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌或宫颈癌。本专利技术还提供了一种抗肿瘤药物，所述药物包含上述多肽PBN3，所述肿瘤选自肺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌或宫颈癌。本专利技术各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本专利技术的特点、目的和优势将更为明显。附图说明图1水饱和正丁醇萃取获得的活性组分过Q阴离子交换层析柱图谱图2活性峰Q1的C18高压液相层析图谱图3抗肿瘤活性肽PBN3的分子质量图图4抗肿瘤活性肽PBN3的氨基酸序列图图5PBN3对不同肿瘤细胞的抑制增殖抑制作用具体实施方式本专利技术提供的新型海洋短芽孢杆菌N189是从南极海水中培养分离得到的能够产生抗肿瘤物质的海洋短芽孢杆菌N189，单独构成一个分支，确定为一种新型菌株，命名为海洋短芽孢杆菌N189(Brevibacillussp.N189)。该菌株于2018年10月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏号为CCTCCNO：M2018662。本专利技术提供的海洋短芽孢杆菌N189为革兰氏阳性菌，好氧菌，有较好的耐盐性，在6.5％NaCl(w/v)培养液中生长良好；生长pH范围为5.5-8.5；生长温度范围较宽，在12℃-37℃环境下也可良好生长。菌株N189的16SrDNA基因经PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物的分子量在1.5kb左右。对菌株N189的16SrDNA基因PCR结果进行序列测定，测得序列长度为1438bp(SEQIDNo.1)。参考《伯杰细菌鉴定手册(第九版)》，结合16SrDNA基因序列相似性分析结果，以及生理生化分析结果，确定菌株N189为短芽孢杆菌属的一种新型菌株，命名为Brevibacillussp.N189。本专利技术提供的抗肿瘤活性多肽PBN3可从菌株N189的代谢产物中分离获得。经MALDI-TOF质谱测定显示其分子量为759.44Da。该多肽的氨基酸序列为LTAHYR(Leu-Thr-Ala-His-Tyr-Arg)(SEQIDNo.2)。本专利技术提供的抗肿瘤药物包含上述多肽PBN3，其对人非小细胞肺癌细胞A549、人大细胞肺癌细胞NCI-H460、人肝癌细胞HepG2、人胰腺癌细胞Panc28、乳腺癌MCF-7和人宫颈癌细胞Hela具有一定的抑制其增殖的作用。下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本专利技术中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1菌株N189的筛选及鉴定1.1.菌株N189的分离和纯化将南极表层海水样品经过0.22μm滤膜抽滤，然后将附菌滤膜存于含25％甘油瓶中，于-80℃冰箱储存。将滤菌膜转移至无菌工作台，粉碎后重溶于样品海水，适度摇动，形成菌液。在常压条件下，取适量菌液涂布于2216E海水分离培养基，置于25℃、静置培养。待单菌落直径约1mm时，再挑取不同单菌落涂布纯化培养。将纯化后的细菌接种于对应液体培养基，适当振荡培养，待对数生长期保存到含25％的无菌甘油管中，-80℃储藏。1.2.菌株N189的发酵培养培养基的配制：蛋白胨5g/L，酵母粉1.0g/L，磷酸高铁0.008g/L，以陈海水配制，121℃、15min灭菌。取1支100μL甘油保种的菌株N189，接种于30mL的培养基，于16℃、200r/min的摇床里恒温培养24h，至对数生长期，即为种子发酵液。用于后续革兰氏染色检测。将种子发酵液按照4％的接种量接种于300mL的培养基中，相同条件下继续培养36h，即为菌种发酵液。固体培养基配制：蛋白胨5g/L，酵母粉1.0g/L，磷酸高铁0.008g/L，琼脂粉2％，加入陈海水配置，121℃、高压蒸汽灭菌15min。制备固体培养基平板，涂布种子发酵液，生长3天，形成单一菌落，用于生理生化实验。1.3菌株N189的菌种鉴定。革兰氏染色：取菌液制成涂片，干燥后固定。再用草酸铵结晶紫染色1min，用蒸馏水清洗染料。加碘液覆盖1min，用水冲洗，吸水纸吸去多余水分。用95％乙醇脱色20s，立即用水洗净并用滤纸吸干。蕃红染色液复染1min，水洗、吸干后镜检，染色结果为紫色，说明其为革兰氏阳性菌。好氧菌，有较好的耐盐性，在6.5％NaCl(w/v)培养液中生长良好；生长pH范围为5.5-8.5；生长温度范围较宽，在12℃-37℃环境下也可良好生长。显微镜形态观察发现在固体培养基的形态特征随着生长时期的不同而变化，在延迟期，菌体呈细长的杆状；在对数生长期，菌体呈短而粗的杆状；在静止期，菌体呈细长的杆状，偶尔能观察到卵圆形的芽孢；周生鞭毛、好氧；菌落乳白色、凸起、边缘不平滑；不透明、不产生色素。在固体培养基平板上挑取纯化的单菌落到无菌水试管中，研磨成0.5麦氏浓度的菌悬液，加到生理生化鉴定管中，根据微生物生理生化试剂盒API20E的说明书进行试验，得到菌株N189的生理生化检测结果(表1)。表1“+”：反应呈阳性或者可以生长、利用：“-”：反应呈阴性或者不可以生长、利用从表1可知，菌株N189的生理生化检测结果为，URE、VP、GEL为阳性，ONPG、ADH、LDC、ODC、H2S、TDA和I本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种由短芽孢杆菌Brevibacillus sp.N189产生的多肽PBN3，其特征在于，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2018662，所述多肽的分子量为759.44Da，所述多肽的氨基酸序列为Leu-Thr-Ala-His-Tyr-Arg(SEQ ID No.2)。/n

【技术特征摘要】
1.一种由短芽孢杆菌Brevibacillussp.N189产生的多肽PBN3，其特征在于，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2018662，所述多肽的分子量为759.44Da，所述多肽的氨基酸序列为Leu-Thr-Ala-His-Tyr-Arg(SEQIDNo.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑兰红，徐一新，林秀坤，王震，宁若男，张彤鑫，
申请(专利权)人：上海健康医学院，
类型：发明
国别省市：上海;31