用于检测HBcAg的方法及抗体技术

本发明专利技术涉及乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)检测领域。具体而言，本发明专利技术提供了采用双抗体夹心法检测HBcAg的方法，以及用于上述检测的抗体及试剂盒。本发明专利技术还提供了能够用于组织或细胞样品的HBcAg免疫学检测的单克隆抗体。

【技术实现步骤摘要】
用于检测HBcAg的方法及抗体
本专利技术涉及乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)检测领域。具体而言，本专利技术提供了采用双抗体夹心法检测HBcAg的方法，以及用于上述检测的抗体及试剂盒。本专利技术还提供了能够用于组织或细胞样品的HBcAg免疫学检测的单克隆抗体。
技术介绍
乙型肝炎病毒感染，尤其是慢性HBV感染是全球最为重要的公共卫生问题之一(DienstagJL.HepatitisBvirusinfection.NEnglJMed2008Oct2；359(14):1486-1500)。目前，HBV血清标志物(常规如：HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb，HBcAb即俗称“两对半”检测)广泛作为现症HBV感染和既往HBV感染的常规检测标准。但是，高的变异率再加上HBV携带者庞大基数导致常规的“两对半”检测的假阴性高发。并且，普通“两对半”检测无法从量上反映病毒复制性和传染性大小，常出现可怀疑难解释的结果，也无法从“两对半”指标直接确定检测个体并未感染HBV。HBVDNA是HBV复制的直接指标，其斑点杂交检测(或PCR检测)是乙型肝炎患者和HBV携带者感染与传染性判断的金标准。PCR检测与斑点杂交检测均可作为HBV感染和传染性的直接指标，但是不适合大规模普查和常规使用。在所有可能与HBVDNA高度相关的血清标志抗原(HBVPreS1、HBcAg、HBxAg、DNAP、HBVPreS2等)中：HBcAg一直被认为是与HBVDNA直接相关的抗原，检测在HBcAg在复制型病毒定量和HBsAg阴性的HBV感染者与HBV患者中特有诊断意义。目前市面上没有开发特异性的HBcAg检测试剂，已报道或者有研发的HBcAg免疫诊断试剂通常采取检测前对样品进行前处理(裂解病毒、破膜并灭火HBcAb)或采用迂回检测HBcAg－HBcAb免疫复合物的方式进行，前者操作复杂程序繁琐，不易被临床客户接受，也不适合用于大规模献血员筛查及流行病学调查，后者则因为检测方法的特殊性，难以达到理想的特异性和灵敏度。2006年有报道的专利“一种联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原和核心抗原的方法及诊断试剂盒”中提到的HBcAg的检测试剂方法是采用sAg的抗体捕获病毒颗粒后进行破膜、裂解病毒检测核内的cAg，但是灵敏度不够。开发一种简单、准确而又高灵敏度的HBcAg发光检测试剂在HBV患者抗病毒疗效及病程预后方面都有迫切的现实意义。
技术实现思路
本专利技术人经过大量的实验研究，出乎意料地发现了特别适用于HBcAg双抗体夹心法检测的结合特定表位的抗体对。在此基础上，本专利技术人开发了新的HBcAg定量检测试剂盒以及检测方法。该检测方法的灵敏度能够达到与DNA相当水平，且可以实现快速、高通量检测，具备重大临床应用价值。试剂盒因此，在第一方面，本专利技术提供了一种试剂盒，其包含：(i)第一抗体，编码第一抗体的分离的核酸分子，包含所述分离的核酸分子的载体，或者表达所述第一抗体的重组细胞；其中，所述第一抗体其选自能够特异性结合HBcAg蛋白的第150-183位中所包含的表位的抗体或其抗原结合片段；和，(ii)第二抗体，编码第二抗体的分离的核酸分子，包含所述分离的核酸分子的载体，或者表达所述第二抗体的重组细胞；其中，所述第二抗体选自能够特异性结合HBcAg蛋白的第141-154位中所包含的表位的抗体或其抗原结合片段。在本文中，表述“HBcAg蛋白的第150-183位中所包含的表位”或类似表述是指，所述表位存在于HBcAg蛋白的第150-183位氨基酸之内或与之重叠。换言之，所述能够特异性结合HBcAg蛋白的第150-183位中所包含的表位的抗体或其抗原结合片段是能够特异性结合HBcAg蛋白的第150-183位氨基酸或其片段的抗体或其抗原结合片段。在某些示例性实施方案中，HBcAg蛋白具有如SEQIDNO:17所示的序列。在某些实施方案中，所述第二抗体选自能够特异性结合HBcAg蛋白的第141-152位中所包含的表位的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述第一抗体选自下列的抗体或其抗原结合片段：(i)抗体或其抗原结合片段，其包含：包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：序列为SEQIDNO:3的HCDR1、序列为SEQIDNO:4的HCDR2、以及序列为SEQIDNO:5的HCDR3；和/或，包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：序列为SEQIDNO:6的LCDR1、序列为SEQIDNO:7的LCDR2、以及序列为SEQIDNO:8的LCDR3；或者，(ii)抗体或其抗原结合片段，其包含：包含SEQIDNO:1所示的重链可变区中含有的3个CDR的重链可变区(VH)；和/或，包含SEQIDNO:2所示的轻链可变区中含有的3个CDR的轻链可变区(VL)；优选地，所述重链可变区中含有的3个CDR，和/或所述轻链可变区中含有的3个CDR，由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义；或者，(iii)抗体或其抗原结合片段，所述抗体是杂交瘤细胞株18B2-2所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株18B2-2保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCNO.C2019303。在某些实施方案中，所述第一抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：(i)SEQIDNO:1所示的序列；(ii)与SEQIDNO:1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或(iii)与SEQIDNO:1所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和/或，(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：(iv)SEQIDNO:2所示的序列；(v)与SEQIDNO:2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或(vi)与SEQIDNO:2所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。在某些实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。在某些实施方案中，所述第一抗体包含：具有如SEQIDNO:1所示的序列的VH和具有如SEQIDNO:2所示的序列的VL。在某些实施方案中，所述第二抗体选自下列的抗体或其抗原结合片段：(i)抗体或其抗原结合片段，其包含：包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：序列为SEQIDNO:11的HCDR1、序列为SEQIDNO:12的HCDR2、以及序列为SEQIDNO:13的HCDR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种试剂盒，其包含：/n(i)第一抗体，其选自能够特异性结合HBcAg蛋白的第150-183位中所包含的表位的抗体或其抗原结合片段；和，/n(ii)第二抗体，其选自能够特异性结合HBcAg蛋白的第141-154位中所包含的表位的抗体或其抗原结合片段。/n

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，其包含：
(i)第一抗体，其选自能够特异性结合HBcAg蛋白的第150-183位中所包含的表位的抗体或其抗原结合片段；和，
(ii)第二抗体，其选自能够特异性结合HBcAg蛋白的第141-154位中所包含的表位的抗体或其抗原结合片段。


2.权利要求1所述的试剂盒，其中，所述第二抗体选自能够特异性结合HBcAg蛋白的第141-152位中所包含的表位的抗体或其抗原结合片段。


3.权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述第一抗体选自下列的抗体或其抗原结合片段：
(i)抗体或其抗原结合片段，其包含：包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：序列为SEQIDNO:3的HCDR1、序列为SEQIDNO:4的HCDR2、以及序列为SEQIDNO:5的HCDR3；和/或，包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：序列为SEQIDNO:6的LCDR1、序列为SEQIDNO:7的LCDR2、以及序列为SEQIDNO:8的LCDR3；或者，
(ii)抗体或其抗原结合片段，其包含：包含SEQIDNO:1所示的重链可变区中含有的3个CDR的重链可变区(VH)；和/或，包含SEQIDNO:2所示的轻链可变区中含有的3个CDR的轻链可变区(VL)；优选地，所述重链可变区中含有的3个CDR，和/或所述轻链可变区中含有的3个CDR，由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义；或者，
(iii)抗体或其抗原结合片段，所述抗体是杂交瘤细胞株18B2-2所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株18B2-2保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCNO.C2019303。


4.权利要求3所述的试剂盒，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：(i)SEQIDNO:1所示的序列；(ii)与SEQIDNO:1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或(iii)与SEQIDNO:1所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：(iv)SEQIDNO:2所示的序列；(v)与SEQIDNO:2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或(vi)与SEQIDNO:2所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQIDNO:1所示的序列的VH和具有如SEQIDNO:2所示的序列的VL。


5.权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其中，所述第二抗体选自下列的抗体或其抗原结合片段：
(i)抗体或其抗原结合片段，其包含：包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：序列为SEQIDNO:11的HCDR1、序列为SEQIDNO:12的HCDR2、以及序列为SEQIDNO:13的HCDR3；和/或，包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：序列为SEQIDNO:14的LCDR1、序列为SEQIDNO:15的LCDR2、以及序列为SEQIDNO:16的LCDR3；或者，
(ii)抗体或其抗原结合片段，其包含：包含SEQIDNO:9所示的重链可变区中含有的3个CDR的重链可变区(VH)；和/或，包含SEQIDNO:10所示的轻链可变区中含有的3个CDR的轻链可变区(VL)；优选地，所述重链可变区中含有的3个CDR，和/或所述轻链可变区中含有的3个CDR，由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义；或者，
(iii)抗体或其抗原结合片段，所述抗体是杂交瘤细胞株2A7所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株2A7保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCNO.C2019302。


6.权利要求5所述的试剂盒，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：(i)SEQIDNO:9所示的序列；(ii)与SEQIDNO:9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或(iii)与SEQIDNO:9所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：(iv)SEQIDNO:10所示的序列；(v)与SEQIDNO:10所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或(vi)与SEQIDNO:10所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQIDNO:9所示的序列的VH和具有如SEQIDNO:10所示的序列的VL。


7.权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其中，所述第一抗体和/或第二抗体包含重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)；
优选地，所述第一抗体和/或第二抗体包含小鼠重链恒定区和小鼠轻链恒定区；
优选地，所述第一抗体和/或第二抗体是IgG、IgM、IgE、IgD或IgA抗体。


8.权利要求1-7任一项所述的试剂盒，其中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdAb)；和/或，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。


9.权利要求1-8任一项所述的试剂盒，其中，所述第二抗体带有可检测标记，或者，所述试剂盒还包括能够特异性结合所述第二抗体的第三抗体，所述第三抗体带有可检测标记；
优选地，所述可检测标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料或生物素。


10.权利要求1-9任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含固相载体；
优选地，所述固相载体选自磁珠或微量滴定板(例如微孔板或酶标板)；
优选地，所述第一抗体包被在固相载体的表面。


11.权利要求1-10任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈自敏，熊君辉，刘嘉祺，王邵娟，葛胜祥，袁权，宋浏伟，孙旭东，
申请(专利权)人：厦门万泰凯瑞生物技术有限公司，厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35