本发明专利技术涉及动物病疫检测领域，具体涉及一种鉴别猪伪狂犬病毒基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量PCR检测试剂盒。在本发明专利技术提供的检测试剂盒中，用于检测猪伪狂犬病毒gI/gE基因缺失情况的引物及探针如SEQ ID NO.1‑3所示。本发明专利技术提供的检测试剂盒中还包括，基于化学法修饰的热启动DNA聚合酶、dUTP/UNG防污染系统、抗PCR抑制物因子。本发明专利技术提供的检测试剂盒敏感性高，最低检测限为189copies/uL。本发明专利技术所述试剂盒适用于复杂的动物临床样本的检测。
【技术实现步骤摘要】
一种鉴别猪伪狂犬病毒基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量PCR检测试剂盒
本专利技术涉及动物病疫检测领域，具体涉及一种鉴别PRV的gI/gE基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量检测试剂盒。
技术介绍
伪狂犬病(Pseudorabies,PR或Aujeszky’sdisease,AD)是一种由伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)感染引起的多种家畜和野生动物共患的急性、热性传染病。伪狂犬病毒能引起猪发生亚临床感染和潜伏感染，但临床症状因日龄不同而异，仔猪常表现高热，食欲废绝，流涎，呼吸困难，震颤和腹泻等症状，继而出现运动失调，间歇性抽搐，昏迷直至死亡(15日龄以内仔猪死亡率常高达100％，断奶仔猪死亡率为10％～20％)；育肥猪仅表现轻微的呼吸道症状，增重减缓等；母猪表现返情，屡配不孕，妊娠母猪常表现流产，产死胎和木乃伊；公猪则常出现睾丸肿胀，萎缩等，种用性能降低或丧失。PRV是一种抵抗力较强的疱疹病毒，有多种蛋白质，在这些蛋白质中，包膜成分蛋白质gB,gC诱导细胞和体液免疫应答，gE蛋白是一个主要的毒力蛋白，能够促进感染细胞和未感染细胞的融合，是病毒入侵中枢神经的必需致病因子。由于gE基因缺失的弱毒疫苗比单独缺失其他基因的PRV疫苗更为安全，所以目前欧盟和美国都规定只准使用gE基因缺失的疫苗。目前所知1200多个伪狂犬病野生毒株，全部含有gE基因，所以gE蛋白抗体有无是鉴别野毒和疫苗株的重要依据。目前认为，gE和gI蛋白共同形成一个非共价结合的复合体，该复合体存在于被感染的细胞膜和病毒囊膜中，该复合体对于PRV在神经系统的侵袭和传播起到一定的作用，但是，gE和gI蛋白没有共同的抗原决定簇。实时荧光定量PCR技术(QuantitativeReal-timePCR，qPCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。与常规PCR相比该技术可快速、灵敏的检测病毒RNA和DNA以及细菌DNA。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鉴别区分PRV的gI/gE基因缺失株与野毒株的方法。尤其是，提供一种鉴别区分PRV野毒株与HB98和HB2000基因缺失株的方法。科前公司的HB98和HB2000为PRV的gI和gE基因部分缺失的疫苗，市面已有的荧光定量检测试剂盒不能检测区分科前生物股份有限公司的HB98和HB2000(gI和gE基因缺失)疫苗株，可能原因是这两个疫苗株缺失的核苷酸序列相对较少，且病毒变异的风险客观存在。本专利技术利用自主设计的引物和探针建立了猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的鉴定、检测方法。为了准确、规范、快速、高效的对猪场进行伪狂犬病毒野毒和gI/gE基因缺失疫苗株的鉴别诊断，本专利技术提供基于TaqMan的实时荧光定量PCR(qPCR)提供对猪伪狂犬病毒野毒病原和gI/gE基因缺失疫苗株进行区分的方法。为了实现本专利技术的目的，第一方面，本专利技术提供荧光定量PCR检测鉴别猪伪狂犬病毒gI/gE基因缺失疫苗株和野毒株的引物和探针，其中，用于鉴别gI/gE基因缺失的引物核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示；用于鉴别gI/gE基因缺失的TaqMan探针核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。具体地，本专利技术提供的引物和探针，主要适用于鉴别猪伪狂犬病毒gI/gE基因缺失疫苗株HB98和HB2000，本专利技术所提供的引物扩增所得片段位于gI和gE基因的连接处。第二方面，本专利技术提供一种荧光定量PCR检测鉴别猪伪狂犬病毒gI/gE基因缺失疫苗株和野毒株的试剂盒，包含上述的引物和探针。在本专利技术提供的试剂盒中还包括阴性对照、阳性对照，所述阳性对照为经实验室检测是PRV阳性样品的核酸，所述阴性对照为经实验室检测是PRV阴性样品的核酸。本专利技术首次对阴阳性对照进行核酸提取，合理有效地减少了本底核酸对实验结果的影响。在本专利技术提供的试剂盒中还包括，基于化学法修饰的热启动DNA聚合酶、dUTP/UNG防污染系统、抗PCR抑制物因子。本专利技术提供的试剂盒中，所使用的酶是基于化学法修饰的热启动DNA聚合酶，配合针对qPCR优化的最适Buffer，可以有效抑制非特异性扩增，进行高灵敏度的qPCR反应。同时引入了dUTP/UNG防污染系统，可完全消除来自之前扩增产物的污染，反应液中添加抗PCR抑制物因子，使本专利技术所提供的方法更适用于复杂的动物临床样本的检测。第三方面，本专利技术提供一种用于非疾病诊断目的鉴别猪伪狂犬病毒疫苗株与野毒株的方法，使用上述的引物和探针或上述的试剂盒对待测样品进行qPCR扩增反应。在本专利技术提供的方法中，所述待测样品为猪血清、粪便、精液、组织、细胞培养物等样品中的猪伪狂犬病病毒的DNA。在本专利技术提供的方法中，qPCR反应体系为2×primer-onestep-mix，10μl；F-primer，0.5μl；R-primer，0.5μl；Probe，1μl；Rnase-Free-H2O，6μl；DNA，2μl；qPCR反应程序为：95℃，2min；95℃，10s；60℃，35s；40个循环。在本专利技术提供的方法中，qPCR扩增反应的结果判定标准为：(1)样本Ct值≤35，判断样本为阳性；(2)35＜样本Ct值≤38，若扩增曲线对数扩增曲线，判断为可疑阳性样本，否则判断样本为阴性；对可疑阳性样本进行复检，若复检样本Ct值≤35，判断可疑阳性样本为阳性，否则判断样本为阴性；(3)样本无Ct值或Ct值＞38，判断样本为阴性。根据本领域技术人员的理解，本专利技术还要求保护，上述引物和探针或上述试剂盒或上述方法在猪伪狂犬病毒流行病学调查中的应用。以及上述引物和探针或上述试剂盒或上述方法在猪伪狂犬病毒疫苗质量检测中的应用。本专利技术的有益效果至少在于：(1)本专利技术提供的引物及探针敏感性高，最低检测限189copies/uL，且可区分市场上所有的猪伪狂犬病毒gI/gE基因缺失疫苗株和野毒株；(2)本专利技术提供的试剂盒适用于复杂的动物临床样本的检测，如猪血清、粪便、精液、组织、细胞培养物等样品中的猪伪狂犬病病毒；(3)本专利技术提供的鉴别方法可以准确高效的鉴别猪伪狂犬病毒gI/gE基因缺失疫苗株HB98和HB2000。附图说明图1为本专利技术实施例2的标准曲线图。图2为本专利技术实施例2的敏感性实验图。图3为本专利技术引物PrV-gI/gE及引物PrV-gI/gE-C阴阳对照扩增的FAM通道结果图。图4为本专利技术国标阴阳对照扩增的FAM通道和HEX通道的结果图。具体实施方式以下实例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的保护范围。若未特别指明，本专利技术实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.荧光定量PCR检测鉴别猪伪狂犬病毒gI/gE基因缺失疫苗株和野毒株的引物和探针，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。/n
【技术特征摘要】
1.荧光定量PCR检测鉴别猪伪狂犬病毒gI/gE基因缺失疫苗株和野毒株的引物和探针，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒gI/gE基因缺失疫苗株为HB98和HB2000。
3.一种荧光定量PCR检测鉴别猪伪狂犬病毒gI/gE基因缺失疫苗株和野毒株的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阴性对照、阳性对照，所述阳性对照为经实验室检测是PRV阳性样品的核酸，所述阴性对照为经实验室检测是PRV阴性样品的核酸。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括，基于化学法修饰的热启动DNA聚合酶、dUTP/UNG防污染系统、抗PCR抑制物因子。
6.一种用于非疾病诊断目的鉴别猪伪狂犬病毒疫苗株与野毒株的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的引物和探针或权利要求3-5任一项所述的试剂盒对待测样品进行qPCR扩增反应。
【专利技术属性】
技术研发人员：汤细彪，黄超，黄英，陈翔鸿，谢思思，杨柳，宋文博，贾双，龙云志，李倩倩，刘锦锦，梁巩，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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