本发明专利技术提供一种非结核分枝杆菌鉴定及其耐药基因突变检测的方法、引物组以及试剂盒。通过采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱技术，可以快速鉴定32种非结核分枝杆菌，同时针对大环内脂类和氨基糖苷类药物相关的耐药基因突变进行检测。根据本发明专利技术提供的方法、引物组以及试剂盒具有灵敏度高、特异性高、检测周期短、成本低、功能范围广的优点，为非结核分枝杆菌的临床检测、治疗和流行病学研究提供了新型检测方法。
【技术实现步骤摘要】
一种非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测的方法、引物组以及试剂盒
本专利技术涉及病原微生物检测，更具体地涉及一种非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测的方法、引物组以及试剂盒。
技术介绍
非结核分枝杆菌(Nontuberculousmycobacteria，简称NTM)是指除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的其它分枝杆菌，系条件致病菌。近年来，非结核分枝杆菌(NTM)病呈快速增多趋势，并已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题。迄今为止，已发现近200种NTM，其中已知具有致病性的有至少40余种。NTM的高危人群主要是慢性呼吸道疾病患者、老年人及免疫功能缺陷者，特別是艾滋病患者。随着人口老龄化、各种免疫抑制剂的使用、艾滋病的流行及医源性感染机会增多、环境污染等诸多因素，导致NTM病呈快速增多趋势。NTM可以侵犯人体肺脏、淋巴结、骨骼、关节、皮肤和软组织等组织器官，并可引起全身播散性疾病。NTM感染肺脏，引起肺部病变称为非结核分枝杆菌肺病。NTM肺病临床表现无特征性，与肺结核在临床症状和影像学方面极为相似。实验室检测方面，NTM与MTB(M.tuberculosis，结核分枝杆菌)均为抗酸染色阳性，仅抗酸染色涂片和分枝杆菌培养的方法，不能很好地鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。因此，NTM肺病易被误诊为肺结核病，且疗效较差，影响结核病的防控工作，因此要加大对非结核分枝杆菌感染的重视力度，增强其临床快速鉴定能力。近年来，NTM病的发病率、患病率在一些国家和地区呈上升趋势，甚至超过结核病的发病率和患病率。我国1979年全国第一次结核病流行病学调查中，NTM的分离率为4.3％。2000年全国第三次结核病流行病学调查结果显示：我国NTM总感染率为11.9％。2010年第五次全国结核病流行病学调查表明，NTM占分枝杆菌分离株的22.9％，较1979年4.3％的分离率明显上升。NTM菌种分布具有明显地域差异是NTM病的另一流行特点，世界各地菌种分布均有所不同。我国由于南北方气候差异各地NTM菌种分布也不尽相同，北京结核病控制研究所报道，1991年从临床痰标本中分离出的NTM以鸟-胞内分枝杆菌复合体(MAC)、龟-脓肿分枝杆菌复合群、戈登分枝杆菌为主。梁莉等报道，1998-2004年上海市NTM感染菌种以Ⅳ群龟分枝杆菌最多，其次为MAC、堪萨斯分枝杆菌等。目前，国内的实验室通常用色谱方法分析特定菌体成分(如脂肪酸、分枝菌酸等)特性，进行分枝杆菌菌种鉴定。色谱法主要有：柱色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。其中气相色谱法、高效液相色谱法是可以进行定量分析的色谱法。同时，色谱检测器的发展还伴随着数据处理技术的发展，检测获得的数据随即进行计算处理，使研究者获得更多信息。1)气相色谱技术：分枝杆菌细胞壁中含有丰富的分枝菌酸(Mycolicacid，MA)。Torkko等[20]采用气相色谱分析全细胞脂肪酸对缓慢生长分枝杆菌的标准菌株检测证实，该技术和传统鉴定方法结果具有良好的一致性，是一种准确度高、实用性强的分枝杆菌菌种鉴定方法。国内刘志辉等应用气相色谱技术对14株分枝杆菌参考菌株和727株分枝杆菌临床分离株进行菌种鉴定，同时采用传统方法进行比对，认为气相色谱技术和传统鉴定方法结果具有良好的一致性，且可通过一次性实验操作将临床中常见的分枝杆菌鉴定到种。2)高效液相色谱技术：将分枝杆菌皂化、提取MA、衍生化为溴代苯甲酰脂肪酸酯而进行高效液相色谱技术分析，对分枝杆菌的鉴别可达种间水平。陈保文等应用反相高效液相色谱法将44株NTM标准株准确鉴定出42株，仅爱知分枝杆菌和罗德岛分枝杆菌无法鉴别。应用色谱法进行NTM菌种鉴定，具有检测时间短、方法稳定可靠、结果准确的特点，但该法需借助较昂贵的仪器来完成，操作复杂，对操作人员技术要求高，且不能鉴别出新的NTM菌种。3)PCR-RFLP技术PCR-RFLP是在PCR和DNA序列分析基础上产生的技术，是一种常见的微生物分型方法。采用相同的限制性内切酶消化不同微生物的DNA扩增片段，经琼脂糖凝胶电泳可得到特征性的限制性片段谱带，通过对电泳图谱的分析可对病原体进行分型。该法结合了PCR快速灵敏与RFLP准确、特异的优点，成本低廉、结果稳定、操作简单，结合软件可分析更为复杂的DNA电泳图谱。常用于PCR-RFLP法诊断分枝杆菌的种特异性保守序列有：IS6110、16SrRNA基因、16S～23SrRNAITS区、hsp65基因、rpoB基因等。rpoB基因序列PCR：采用双重PCR的方法，以rpoB基因为靶基因设计引物，分别扩增结核分枝杆菌(MTB)和NTM的235和136bp的基因片段，对44株分枝杆菌参考株和379株临床分离株进行检测，并进一步对186株NTM选用限制性内切酶MspI、HaeII进行酶切鉴定和序列测定。结果表明，该方法可以准确、快速的对MTB和NTM进行鉴别，敏感性和特异性均为100％，并能将NTM鉴定到种。hsp65基因序列PCR-RFLP分析技术：编码热休克蛋白的hsp65基因保守性较强，存在于所有分枝杆菌中，以hsp65基因作为PCR扩增的靶基因结合产物直接测序可以很好的将NTM鉴定到种，克服了因扩增产物长度不够而难以对NTM种及亚种鉴定的缺陷。4)PCR-SSCP技术：MTB的16SrDNA在123～276bp完全相同，与其它22种分枝杆菌存在几个碱基的差异。国内靳晓红等用PCR-SSCP方法通过设计2对引物分别扩增16SrDNA2条片段，根据SSCP电泳图谱与结核分枝杆菌标准株的相似性鉴别结核分枝杆菌、NTM，对98株临床分离株进行分析。结果表明，该方法对MTB及NTM的鉴别比细菌学方法快速，仅用3天，且与细菌学方法具有良好的一致性。该方法可及时鉴别MTB与NTM，对于临床复治、难治结核病的诊断及药物选择有重要作用。5)基因芯片技术：基因芯片法是指将大量核酸分子以预先设计的方式固定在载体上，检测带标记的待测样品DNA，与传统检测方法相比，具有检测时间短、通量高等优点，是一种大规模分析遗传差异的新方法。目前商品化的分枝杆菌菌种鉴定试剂盒如博奥生物公司DNA微阵列芯片法可以快速检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、戈氏分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌等17种临床常见分枝杆菌，将常规的检测时间大大缩短，在8h内即可得到结果。6)基因探针技术：基因探针技术包括以德国HainLifescience公司的LiquidArray代表的DNA探针技术和以美国GeneProbe公司的AccuProbe技术为代表的RNA探针技术，同时还包括基因芯片技术。LiquidArray应用生物素标记的特异性探针，探针序列为各种标准菌株23SrRNA的特异序列，标记的探针通过与亲和素标记的PCR产物杂交显色后，不同NTM菌种会在试纸条上出现特定的条带，最后通过条带显色的差异区分不同的菌种类别。该试剂包括常见NTMHAIN基因分型试剂盒(CM)和非典型NTMHAIN基因分型试刺盒(AS)两种，CM试纸能鉴定临床最常见的15种NTM，如鸟本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种非结核分枝杆菌鉴定的引物组，其特征在于，所述非结核分枝杆菌鉴定的引物组包括如下所示的7对扩增引物：/n
【技术特征摘要】
1.一种非结核分枝杆菌鉴定的引物组，其特征在于，所述非结核分枝杆菌鉴定的引物组包括如下所示的7对扩增引物：
基因位点
扩增引物(5’-3’)
T
SEQIDNo.1～2
RB-1
SEQIDNo.3～4
RB-2
SEQIDNo.5～6
mce3B-1
SEQIDNo.7～8
ITS1
SEQIDNo.9～10
mce3B-2
SEQIDNo.11～12
BGAL
SEQIDNo.13～14
所述非结核分枝杆菌鉴定的引物组还包括如下所示的40条延伸引物：
2.一种非结核分枝杆菌耐药基因突变检测的引物组，其特征在于，所述非结核分枝杆菌耐药基因突变检测的引物组包括如下所示的4对扩增引物：
基因位点
扩增引物(5’-3’)
rrl23
SEQIDNo.55～56
rrs1406
SEQIDNo.57～58
erm_28
SEQIDNo.59～60
erm_276
SEQIDNo.61～62
所述非结核分枝杆菌耐药基因突变检测的引物组还包括如下所示的8条延伸引物：
基因位点
延伸引物(5’-3’)
rrl2058
SEQIDNo.63
rrl2059
SEQIDNo.64
rrs1406
SEQIDNo.65
rrs1408
SEQIDNo.66
rrs1409
SEQIDNo.67
erm_28
SEQIDNo.68
erm_276
SEQIDNo.69
erm_64
SEQIDNo.70
。
3.一种非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测的引物组，其特征在于，所述引物组包括根据权利要求1所述的非结核分枝杆...
【专利技术属性】
技术研发人员：何炯，张辉，黄成琛，
申请(专利权)人：上海康黎诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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