一种利用古菌分子标记OTU300快速检测城市绿地土壤全氮含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用古菌分子标记OTU300快速检测城市绿地土壤全氮含量的方法。本发明专利技术提供了一种DNA分子(探针)，如序列表的序列1所示。本发明专利技术还保护所述探针在检测或辅助检测土壤全氮含量中的应用。本发明专利技术还保护所述探针在比较不同地块的土壤全氮含量中的应用。采用本发明专利技术提供的方法检测土壤全氮含量或比较不同地块的土壤全氮含量，具有如下优点：样品需求量小，无需前处理，所需时间短，人力成本低，可以实现对大批量样品的快速自动化检测。本发明专利技术对于土壤样品的测评具有重要应用推广价值。

【技术实现步骤摘要】
一种利用古菌分子标记OTU300快速检测城市绿地土壤全氮含量的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种利用古菌分子标记OTU300快速检测城市绿地土壤全氮含量的方法。
技术介绍
城市园林绿化建设是生态文明建设和美丽中国建设的重要组成部分，对优化城市环境，提高人民生活质量，促进城市可持续发展起着重要作用。城市绿地土壤作为城市生态环境的物质基础，其质量直接影响着植物的健康生长以及生态效益、景观功能的发挥，在一定程度上决定着城市绿地质量。因此，对城市绿地土壤质量进行科学客观的监测和评价，是城市绿地管理的重要参考和依据。目前对城市绿地土壤质量指标的检测主要是沿用传统的理化检测方法，样品需求量大，样品前处理过程复杂、周期长，尤其所需要的人力资源成本较高，难以实现对大批量样品的快速检测。土壤微生物对土壤环境的变化具有综合性、敏感性和功能性的特点，探索通过检测特定微生物类群的丰度来实现对绿地土壤质量指标的快速和自动化检测技术具有重要的现实意义。土壤全氮是土壤肥力质量的重要指标，土壤全氮包括所有形式的有机态和无机态氮，是标志土壤氮素总量和供应植物有效氮素的源和库，能够综合反映土壤氮素状况、评估土壤供氮能力。土壤全氮受成土母质、地形、气候、生物等自然因素以及绿化养护等人为因素共同影响，其在土壤中的分布表现出显著的空间异质性。土壤全氮已成为世界各国土壤质量分析和实验室测定的例行项目。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用古菌分子标记OTU300快速检测城市绿地土壤全氮含量的方法。r>本专利技术提供了引物探针组，由特异引物对和特异探针组成；所述特异引物对由序列表的序列4所示的引物524F-10-ext和序列表的序列5所示的引物Arch958R-mod组成；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列1所示。所述特异探针为Taqman探针。所述Taqman探针的5’末端具有荧光基团，3’末端具有荧光淬灭基团。所述荧光基团具体可为FAM。所述荧光淬灭基团具体可为TAMRA。本专利技术还保护所述引物探针组在检测或辅助检测土壤全氮含量中的应用。本专利技术还保护所述引物探针组在比较不同地块的土壤全氮含量中的应用。本专利技术还保护一种试剂盒，包括所述引物探针组。所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：(a)检测或辅助检测土壤全氮含量；(b)比较不同地块的土壤全氮含量所述试剂盒还包括记载有如下所述方法甲或方法乙的载体。本专利技术还提供了一种DNA分子(探针)，如序列表的序列1所示。本专利技术具体提供了一种Taqman探针，其核苷酸序列如序列表的序列1所示。所述Taqman探针的5’末端具有荧光基团，3’末端具有荧光淬灭基团。所述荧光基团具体可为FAM。所述荧光淬灭基团具体可为TAMRA。本专利技术还保护所述DNA分子或所述Taqman探针在检测或辅助检测土壤全氮含量中的应用。本专利技术还保护所述DNA分子或所述Taqman探针在比较不同地块的土壤全氮含量中的应用。本专利技术还保护一种检测土壤全氮含量的方法(方法甲)，包括如下步骤：以土壤样品的总DNA为模板，进行实时荧光定量PCR；实时荧光定量PCR的扩增引物对由序列表的序列4所示的引物524F-10-ext和序列表的序列5所示的引物Arch958R-mod组成；实时荧光定量PCR的探针的核苷酸序列如序列表的序列1所示；实时荧光定量PCR获得Ct值；根据Ct值计算拷贝数，通过土壤样品中的拷贝数含量计算得到土壤样品中的全氮含量。实时荧光定量PCR的探针为Taqman探针。所述Taqman探针的5’末端具有荧光基团，3’末端具有荧光淬灭基团。所述荧光基团具体可为FAM。所述荧光淬灭基团具体可为TAMRA。所述拷贝数为所述探针的靶标片段的拷贝数。通过土壤样品中的拷贝数含量计算得到土壤样品中的全氮含量的实现方法为：将土壤样品的拷贝数含量代入线性方程，得到土壤样品的全氮含量。线性方程为：y＝0.0361x+0.6785；R2＝0.9151；y代表全氮含量，单位为g/kg；x代表目标OUT的拷贝数含量，单位为×106拷贝数/g。根据Ct值计算拷贝数的方法为：将Ct值代入标准曲线方程，得到拷贝数。所述标准曲线方程的制备方法为：将序列表的序列2所示的DNA分子与pMD18-T载体连接，得到OTU300标准品质粒；采用OTU300标准品质粒制作以拷贝数的对数为自变量且以Ct值为因变量的标准曲线方程。拷贝数的对数为拷贝数以10为底的对数。土壤样品的总DNA的制备方法：采用MoBio强力DNA提取试剂盒(MoBioLaboratories,Carlsbad,Inc.,CA,USA)提取土壤样品的总DNA。实时荧光定量PCR具体采用96实时荧光定量PCR仪。实时荧光定量PCR的反应体系(20μL)：10μLPremixExTaq(Takara,Dalian,China)、0.4μL引物524F-10-ext、0.4μL引物Arch958R-mod、0.2μL探针、2μL模板溶液和7μL无菌水。反应体系中，引物524F-10-ext的浓度为0.2μM，引物Arch958R-mod的浓度为0.2μM，探针的浓度为0.1μM。反应体系中，模板DNA的含量为7ng。实时荧光定量PCR的反应程序：95℃预变性120s；95℃变性10s、60℃退火延伸45s，45个循环。本专利技术还保护一种比较不同地块的土壤全氮含量的方法(方法乙)，包括如下步骤：将两个以上地块的土壤样品分别按照方法甲进行检测；根据检测结果比较各个地块的土壤全氮含量。以上任一所述土壤为绿地土壤。以上任一所述地块为绿地地块。以上任一所述土壤为城市绿地土壤。以上任一所述地块为城市绿地地块。以上任一所述土壤为长江三角洲的绿地土壤。以上任一所述地块为长江三角洲的绿地地块。以上任一所述土壤为长江三角洲的城市绿地土壤。以上任一所述地块为长江三角洲的城市绿地地块。以上任一所述土壤为公园绿地土壤。以上任一所述地块为公园绿地地块。以上任一所述土壤为城市公园绿地土壤。以上任一所述地块为城市公园绿地地块。以上任一所述土壤为长江三角洲的公园绿地土壤。以上任一所述地块为长江三角洲的公园绿地地块。以上任一所述土壤为长江三角洲的城市公园绿地土壤。以上任一所述地块为长江三角洲的城市公园绿地地块。长江三角洲为上海市、江苏省和浙江省。以上任一所述土壤样品取自0-20cm表层土壤。采用本专利技术提供的方法检测土壤全氮含量或比较不同地块的土壤全氮含量，具有如下优点：样品需求量小，无需前处理，所需时间短，人力成本低，可以实现对大批量样品的快速自动化检测。本专利技术对于土壤样品的测评具有重要应用推广价值。附图说明图1为目标OTU的拷贝数含量与土壤全氮含量的线性关系。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物探针组，由特异引物对和特异探针组成；所述特异引物对由序列表的序列4所示的引物524F-10-ext和序列表的序列5所示的引物Arch958R-mod组成；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列1所示。/n

【技术特征摘要】
1.引物探针组，由特异引物对和特异探针组成；所述特异引物对由序列表的序列4所示的引物524F-10-ext和序列表的序列5所示的引物Arch958R-mod组成；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列1所示。


2.权利要求1所述引物探针组在检测或辅助检测土壤全氮含量中的应用。


3.权利要求1所述引物探针组在比较不同地块的土壤全氮含量中的应用。


4.一种试剂盒，包括权利要求1所述引物探针组。


5.一种DNA分子，如序列表的序列1所示。


6.一种Taqman探针，其核苷酸序列如序列表的序列1所示。


7.权利要求5所述DNA分子或权利要求6所述Taqman探针在检测或辅助检测土壤全氮含量中的应用。

【专利技术属性】
技术研发人员：韩继刚，张浪，张维维，赵刚勇，
申请(专利权)人：上海市园林科学规划研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31