濒危半红树植物莲叶桐核酸提取的方法技术

本发明专利技术属于分子生物学方面，具体涉及一种针对濒危半红树植物莲叶桐核酸的提取方法。采用改进的裂解液对细胞进行裂解，并通过一定比例的Tris平衡酚‑氯仿‑异戊醇混合液进行抽提，同时为了更彻底的清除糖蛋白，又用等体积的Tris平衡酚进行抽提。再用改进体积的醋酸钠‑异丙醇进行沉淀DNA、纯化DNA，从而获得高质量的基因组DNA。采用本发明专利技术提供的濒危半红树植物莲叶桐核酸提取方法提取的DNA浓度高、纯度高，还不易降解，同时可以防止超氧阴离子自由基或者活性氧对DNA的损害，为后续的PCR扩增、分子标记技术开发、基因组文库构建等分子生物学实验奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
濒危半红树植物莲叶桐核酸提取的方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种濒危半红树植物莲叶桐核酸提取的方法。
技术介绍
莲叶桐(Hernandianymphaeifolia(J.Presl)Kubitzki)是莲叶桐科、莲叶桐属常绿乔木，莲叶桐材料因富含多糖、多酚，成分特殊，提取液极其粘稠，且容易褐化，所以核酸提取较困难。传统的SDS法(1)称取0.2g样品用液氮研磨成粉,置于1.5ml离心管中，加入800μL经65℃预热的SDS裂解液(100mmol/LTris-HCl,pH8.0,50mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,2％β疏基乙醇(v/v),5％SDS(m/v)),放入65℃水浴锅中保温20min。(2)于4℃,12000rpm离心10min.上清移入新的1.5ml离心管中，加入等体积的KAc,轻轻旋转混匀，静置片刻，而后4℃,12000rpm/min离心10min。(3)上清移入新的1.5ml离心管中,加入2倍体积的预冷的无水乙醇,轻轻混匀,在－20℃条件下静置30min,于4℃,12000rpm/min离心10min,去上清,留沉淀。(4)用500μL70％的乙醇洗涤沉淀,重复2～3次。(5)彻底吸弃上清,加入200μLTE缓冲液溶解干燥的DNA,加入2μL(10mg·ml－1)RNaseA,在37℃条件下保温30min,最后将DNA溶解在100μLTE缓冲液中,于－20℃保存备用。采用传统SDS法提取莲叶桐植物基因组DNA过程中出现的上清液粘稠,裂解时多糖处理不干净，点样跑胶时出现枪头拉丝等问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为：如何提供一种适用于莲叶桐核酸提取的方法，解决采用传统SDS法提取时出现的上清液粘稠，裂解时多糖处理不干净，点样跑胶时出现枪头拉丝等问题。本专利技术的技术方案为：莲叶桐核酸提取的方法，包括如下步骤：(1)取适量新鲜莲叶桐叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨，将粉末转至离心管中，加入预热温度为65℃的裂解液，上下颠倒混匀，加入RNA酶，涡旋振荡1min，裂解液组成为：100mmol/LTris-HClpH8.0，50mmol/LEDTA，500mmol/LNaCl，2％(V/V)β疏基乙醇，5％(m/v)SDS，2％(m/v)PVP。(2)混匀后65℃水浴10min，加入等体积的抽提液振荡混匀，抽提液组成为Tris平衡酚︰氯仿︰异戊醇＝25︰24︰1，在转速为11000～135000rpm室温下离心10～15min。(3)取上清液转入一新离心管加入等体积的Tris平衡酚(pH>7.8)振荡混匀，在转速为11000～135000rpm4℃离心15～20min。(4)取上清液，加入1/10倍体积的3mol/LNaAc(pH5.6)和两倍体积的异丙醇，混匀后，至于－20℃中过夜，在转速为11000～135000rpm4℃离心15～20min。(5)弃上清，沉淀用体积浓度70％乙醇(v/v)洗涤2～4次,加入50～250μLTE,充分混匀后,加入1/10倍体积的3mol/LNaAc(pH5.6)和两倍体积的异丙醇，混匀后，至于－20℃中2h。在转速为11000～135000rpm/min室温下离心10～15min。(6)弃上清，沉淀用体积浓度70％(v/v)乙醇洗涤2～4次，室温静置20～30min晾干，加入50～250μL的TE，充分混匀后，置于-20℃保存。进一步地，所述步骤(1)中的RNA酶浓度为20mg/ml，一般加入2～4μL。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、裂解液组分：增加了PVP、β疏基乙醇、RNaseA。PVP化学名称为聚乙烯吡咯烷酮，它是一种具有较强的溶解性的抗氧化剂。它能够与多酚、多糖结合形成络合物，使得多酚多糖与DNA分离，从而去除杂质。β疏基乙醇主要是抗氧化，它能防止DNA呈褐色，避免植物体内的多酚物质氧化成醌，减少对核酸的损失。加入RNaseA可有效去除DNA中的RNA以及其他的蛋白质杂质。2、抽提液组分：在传统的氯仿︰异戊醇抽提液中，加入了Tris平衡酚。酚能够保持DNA中的水分,减少DNA的损失。3、添加步骤：在第二次抽提时，采用等体积的Tris平衡酚去抽提，Tris平衡酚的作用是防止酚类氧化成醌，醌对核酸有较强的破坏作用。酚又是强的蛋白变性剂，可以使细胞、组织中的蛋白质变性而析出。因此该步骤能够达到减少核酸的损失，高效去除蛋白的作用。4、沉淀DNA试剂与时间要求：采用醋酸钠和异丙醇沉淀DNA，把95％乙醇改成异丙醇，异丙醇具有用量少、速度快的特点，比较适合浓度低、体积大的DNA沉淀。醇类物质具有沉淀DNA，去除多糖的作用。附图说明图1为实施例1与实施例2的对比图，左管为加热前裂解液中未加PVP，右管为加热前裂解液中加PVP。图2为实施例1与实施例2的对比图，左管为裂解液中加PVP加热后现象，右管为裂解液中未加PVP加热后现象。图3为实施例1与实施例2的对比图，左管为抽提液中加入Tris平衡酚，右管为抽提液中未加Tris平衡酚。图4莲叶桐DNA琼脂糖凝胶电泳图，Improved1为实施例1提取物的琼脂糖凝胶电泳图，Improved2为实施例2提取物的琼脂糖凝胶电泳图。图5为莲叶桐DNA琼脂糖凝胶电泳图，其中SDS是指本实施例2的方法提取物的琼脂糖凝胶电泳图，多糖多酚试剂盒为TIANGEN多糖多酚植物核酸提取试剂盒；普通试剂盒为BIOTAKE新型快速植物核酸提取试剂盒。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。实施例1(1)取适量新鲜植物叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨。将粉末转至2mL的离心管中，加入预热温度为65℃的质量浓度5％SDS(m/v)裂解液，上下颠倒混匀，加入RNA酶，涡旋振荡1min；(2)混匀后65℃水浴10min；加入等体积的氯仿︰异戊醇＝24︰1振荡混匀，在转速为11000～135000rpm/min室温下离心10～15min。(3)取上清液转入一新离心管加入等体积的Tris平衡酚(pH>7.8)振荡混匀，在转速为11000～135000rpm/min4℃离心15～20min。(4)取上清液转入一新的离心管，加入1/10倍体积的3mol/LNaAc(pH5.6)和等体积的异丙醇，混匀后，至于－20℃中过夜，在转速为11000～135000rpm/min4℃离心15～20min。(5)弃上清沉淀用体积浓度70％乙醇洗涤2～4次，室温静置20～30min晾干，加入50～250μLTE，充分混匀后，置于-20℃保存。实施例2(1)取适量新鲜植物叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨。将粉末转至2mL的离心管中，加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.莲叶桐核酸提取的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)取适量新鲜莲叶桐叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨，将粉末转至离心管中，加入预热温度为65℃的裂解液，混匀，加入RNA酶，涡旋振荡1min；裂解液组成为：100mmol/L Tris-HClpH8.0，50mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，2％(v/v)β疏基乙醇，5％(m/v)SDS，2％(m/v)PVP；/n(2)混匀后65℃水浴10min，加入等体积的抽提液振荡混匀，抽提液组成为Tris平衡酚︰氯仿︰异戊醇＝25︰24︰1，在转速为11000～135000rpm室温下离心10～15min；/n(3)取上清液转入一新离心管加入等体积的Tris平衡酚振荡混匀，在转速为11000～135000rpm4℃离心15～20min；/n(4)取上清液，加入1/10倍体积的3mol/L NaAc和两倍体积的异丙醇，混匀后，至于－20℃中过夜，在转速为11000～135000rpm4℃离心15～20min；/n(5)弃上清，沉淀用体积浓度70％乙醇洗涤2～4次，加入50～250μL TE，充分混匀后，加入1/10倍体积的3mol/L NaAc和两倍体积的异丙醇，混匀后，至于－20℃中2h，在转速为11000～135000rpm室温下离心10～15min；/n(6)弃上清，沉淀用体积浓度70％乙醇洗涤2～4次，室温静置20～30min晾干，加入50～250μL的TE，充分混匀后，置于-20℃保存。/n...

【技术特征摘要】
1.莲叶桐核酸提取的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取适量新鲜莲叶桐叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨，将粉末转至离心管中，加入预热温度为65℃的裂解液，混匀，加入RNA酶，涡旋振荡1min；裂解液组成为：100mmol/LTris-HClpH8.0，50mmol/LEDTA，500mmol/LNaCl，2％(v/v)β疏基乙醇，5％(m/v)SDS，2％(m/v)PVP；
(2)混匀后65℃水浴10min，加入等体积的抽提液振荡混匀，抽提液组成为Tris平衡酚︰氯仿︰异戊醇＝25︰24︰1，在转速为11000～135000rpm室温下离心10～15min；
(3)取上清液转入一新离心管加入等体积的Tris平衡酚振荡混匀，在转速为11000～135000rpm4℃离心15～20min...

【专利技术属性】
技术研发人员：王勇，倪靓，谭佐莉，张修含，于靖，张世杰，
申请(专利权)人：海南师范大学，
类型：发明
国别省市：海南;46