结合人RAGE胞外域的羊驼源抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种能以高亲和力结合人RAGE胞外域的羊驼源抗体，该抗体又称为纳米抗体，其能够用于预防、治疗和/或诊断与RAGE相关的病症。的病症。的病症。

Alpaca antibody binding to extracellular domain of human rage

The invention discloses an alpaca antibody which can bind to extracellular domain of human rage with high affinity, and the antibody is also called nano antibody, which can be used for prevention, treatment and / or diagnosis of rage related diseases. It's a disease of the heart. It's a disease of the heart< br/>

【技术实现步骤摘要】
结合人RAGE胞外域的羊驼源抗体


[0001]本专利技术属于生物制药领域，并且特别涉及用于治疗和诊断的抗人RAGE(hRAGE)胞外域的纳米抗体。

技术介绍

[0002]晚期糖基化终末产物受体(RAGE)是免疫球蛋白超家族的成员。RAGE不仅参与糖尿病慢性并发症的发生、发展，还与炎症反应、肿瘤的侵袭和迁移、神经再生、肾病、动脉硬化、Alzheimer病有关。RAGE是一种具有重要功能的多配体受体，RAGE的配体包括晚期糖基化终末产物(AGE)、高迁移率族盒1蛋白、S100蛋白家族、羧甲基赖氨酸、淀粉样β肽等。
[0003]RAGE的结构包括胞外域(23
‑
342位氨基酸残基)，跨膜域(19个氨基酸残基)及细胞内域(41个氨基酸残基)。胞外域包括一个可变V结构域(23
‑
116位氨基酸残基，AQNITARIGEPLVLKCKGAPKKPPQRLEWKLNTGRTEAWKVLSPQGGGPWDSVARVLPNGSLFLPAVGIQDEGIFRCQAMNRNGKETKSNYRVR)(SEQ ID NO：1)和两个恒定结构域C1(124
‑
221位氨基酸残基，PEIVDSASELTAGVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWHLDGKPLVPNEKGVSVKEQTRRHPETGLFTLQSELMVTPARGGDPRPTFSCSFSPGLPRHRALR)(SEQ ID NO：2)和C2(227
‑
317位氨基酸残基，PRVWEPVPLEEVQLVVEPEGGAVAPGGTVTLTCEVPAQPSPQIHWMKDGVPLPLPPSPVLILPEIGPQDQGTYSCVATHSSHGPQESRAVS)(SEQ ID NO：3)。
[0004]拮抗生理配体与RAGE的结合可下调由过量浓度的AGE及其它RAGE配体引起的病理生理变化。通过减少内源性配体与RAGE的结合可减少与RAGE介导的病症相关的症状。可溶性RAGE能有效拮抗RAGE配体与RAGE结合。然而，可溶性RAGE在活体内施用时半衰期可能太短而不适于治疗一种或多种病症。因此，需要研制拮抗AGE及其它生理配体结合RAGE的药物。
[0005]RAGE的V可变域被认为是主要的配体结合域，因此靶向RAGE的V可变域的小分子抑制剂可能具有临床价值，例如单域抗体。单域抗体，也称为纳米抗体(Nbs)，是骆驼科(骆驼、美洲驼、羊驼)动物产生的小型抗体。该纳米抗体具有最小的可变抗原结合片段，被称为VHH结构域，其分子量约为15kDa。与常规抗体相比，纳米抗体具有独特的优势：1)纳米抗体结构简单、分子量小，更有利于表达和使用；2)更方便在大肠杆菌和各种真核系统中高效大量表达；3)由于其只有一个结合位点，属于单域抗体，作为诊断试剂有更好的通透性、特异性和检测线性；4)便于与各种融合蛋白偶联或更容易被各种标记物标记；5)更易于制备双功能抗体，更有利于靶向药物开发和细胞靶点定向运输；6)作为药物开发，其对于人免疫原性小，不容易产生免疫排斥。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了能以高亲和力结合人RAGE胞外域的羊驼源抗体，该抗体又称为纳米抗体，其能够用于预防、治疗和/或诊断与RAGE相关的病症。
[0007]本专利技术人使用重组的RAGE胞外域对羊驼进行了4次免疫，然后分离出外周血淋巴细胞，并抽提细胞的总RNA，随后反转录为cDNA，将cDNA用作模板以扩增纳米抗体序列。我们
分离获得了3种纳米抗体，分别命名为3CNB、4BNB和5ENB。这些纳米抗体的氨基酸序列分别如下：
[0008]3CNB的氨基酸序列：
[0009]QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCGASGSIFSIHTMGWYRQAPGQERELVAAISSFGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQVNSLKPEDTAMYYCVGREHHNGPYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:6)
[0010]4BNB的氨基酸序列：
[0011]QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSDYVMGWFQQAPGKEREFVAAISWSGGKTYYTDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGSGRGTYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:7)
[0012]5ENB的氨基酸序列：
[0013]QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASTRAFSNYAIGWFRQAPGKEREFVAAISWSGASTYYADSVKGRCTISRDDSKNTVYLQMNSLKPEDTGVYYCAAQEGDTRRYDYWGQGTQVIVSS(SEQ ID NO:8)
[0014]这3种纳米抗体的三个抗原互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)如划线部分所示，具体如下：
[0015]3CNB的抗原互补决定区：
[0016]CDR1:GSIFSIHTM(SEQ ID NO:9)
[0017]CDR2:LVAAISSFGS(SEQ ID NO:10)
[0018]CDR3:VGREHHNGP(SEQ ID NO:11)
[0019]4BNB的抗原互补决定区：
[0020]CDR1:GRTFSDYVM(SEQ ID NO:12)
[0021]CDR2:FVAAISWSGGK(SEQ ID NO:13)
[0022]CDR3:AAGSGRGT(SEQ ID NO:14)
[0023]5ENB的抗原互补决定区：
[0024]CDR1:TRAFSNYAI(SEQ ID NO:15)
[0025]CDR2:FVAAISWSGAS(SEQ ID NO:16)
[0026]CDR3:AAQEGDTRR(SEQ ID NO:17)
[0027]具体地，本专利技术提供了以下各项技术方案：
[0028]一方面，本专利技术提供抗体或其抗原结合片段，优选特异性结合(例如，人)RAGE胞外域，优选所述抗体或其抗原结合片段源自羊驼，优选地，所述抗体为仅包括重链抗体的纳米抗体，其特征在于，所述抗体包含：
[0029]CDR1，其包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:15所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；
[0030]CDR2，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:16所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗体或其抗原结合片段，优选特异性结合(例如，人)RAGE胞外域，优选所述抗体或其抗原结合片段源自羊驼，优选地，所述抗体为仅包括重链抗体的纳米抗体，其特征在于，所述抗体包含：CDR1，其包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:15所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；CDR2，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:16所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；和CDR3，其包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:17所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括选自如下组的序列：(a)如SEQ ID NO:9所示的CDR1，如SEQ ID NO:10所示的CDR2和如SEQ ID NO:11所示的CDR3；(b)如SEQ ID NO:12所示的CDR1，如SEQ ID NO:13所示的CDR2和如SEQ ID NO:14所示的CDR3；和(c)如SEQ ID NO:15所示的CDR1，如SEQ ID NO:16所示的CDR2和如SEQ ID NO:17所示的CDR3。3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括选自如下组中的一个或多个的序列：(a)如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，(b)与如SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：金腾川，艾哈迈德，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：