肌肉和视网膜特异性的新型腺相关病毒衣壳蛋白制造技术

本发明专利技术涉及新型AAV衣壳蛋白、编码该衣壳蛋白的核酸分子、包含该衣壳蛋白的载体以及包含该载体的药物。本发明专利技术的AAV载体具有良好的肌肉和视网膜组织靶向特异性，其可作为治疗性基因的送递载体用于治疗相关疾病。基因的送递载体用于治疗相关疾病。基因的送递载体用于治疗相关疾病。

Novel adeno-associated virus capsid protein specific for muscle and retina

【技术实现步骤摘要】
肌肉和视网膜特异性的新型腺相关病毒衣壳蛋白


[0001]本公开属于基因治疗
具体地，本公开涉及肌肉和视网膜特异性的新型腺相关病毒衣壳蛋白、编码该衣壳蛋白的核酸分子、包含该衣壳蛋白的载体以及包含该载体的药物。

技术介绍

[0002]近年来，基因治疗蓬勃发展。作为在治疗性基因送递方面非常有前景的载体，腺相关病毒(AAV，adeno
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associated virus)在各种器官组织中具有高转导效率、长期治疗效果和低致病性，这些特性使AAV在基因治疗领域具有明显的优势(参考文献1)。然而，野生型AAV血清型通常广谱地感染哺乳动物的多个组织/器官。因此，目前AAV的应用仍存在以下问题：野生型AAV具有广泛的组织靶向性，导致基因传递到脱靶的组织，从而加剧了不良反应。
[0003]迄今为止，已经开发了靶向不同器官(例如眼睛或骨骼肌)的AAV载体。例如，在2017年底，Spark Therapeutics生产的基于AAV2的基因治疗药物“Luxturna”已经被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗患有RPE65突变的莱伯氏先天性黑蒙病(Leber Congenital Amaurosis，LCA)。在2019年5月，FDA批准了基于AAV9的药物“Zolgensma”用于治疗脊髓性肌萎缩，这是一种由SMN基因突变引起的神经肌肉疾病。利用AAV作为载体的基因疗法已经在许多临床试验中得以运用，例如，这些基因疗法利用靶向眼睛或肌肉的AAV作为载体来治疗多种眼部和肌肉疾病(例如与年龄相关的黄斑变性、X连锁视网膜分裂症和杜氏肌肉营养不良)，且取得了不错的治疗效果。
[0004]研究显示，AAV载体的组织亲嗜性及细胞转化效率主要由其衣壳决定。不同的衣壳决定了不同的AAV具有不同的组织亲嗜性及转化效率。为了改善AAV载体的组织特异性以及减轻免疫反应，可以采用例如DNA混编(DNA shuffling)、易错PCR和定点突变的方法来改造AAV衣壳。通常，可以采用定点突变技术在AAV的衣壳蛋白中插入7
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20个氨基酸的多肽。例如，通过在AAV9的第588位氨基酸后插入7个氨基酸而获得的AAVPHP.B可改善血脑屏障通透性(参考文献2)。
[0005]因此，为了实现更好的治疗效果，期望对AAV衣壳蛋白进行合适的改造，获得具有器官特异性的新型腺相关病毒载体。
[0006]参考文献：
[0007]1.Li et al.,Nat Rev Genet(2020)21:255
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272
[0008]2.Deverman et al.,Nat Biotechnol(2016)34:204
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209

技术实现思路

[0009]经过大量研究，专利技术人发现，通过在AAV(例如AAV5)衣壳蛋白的可变区(例如在N573或Q574后)插入寡肽“PLPSPSRL”，可以获得靶向视网膜和肌肉的新型AAV(例如AAV5)衣壳。由该新型AAV衣壳包装的新型AAV载体具有良好的肌肉和视网膜组织靶向特异性，有更低的毒副作用和更好的安全性潜力，可应用于肌肉或眼部相关疾病的预防、诊断和治疗。
[0010]因此，本公开提供了新型AAV衣壳蛋白，其可在体内或体外在肌肉细胞和视网膜细胞转导。该新型AAV衣壳蛋白可用于生产新型AAV载体，从而开展针对新型AAV载体的相关研究或可用于疾病治疗。
[0011]在第一方面，本公开提供一种新型腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，所述新型AAV衣壳蛋白通过在AAV衣壳蛋白的可变区插入寡肽PLPSPSRL构建而成。
[0012]上述腺相关病毒(AAV)可以选自任何AAV血清型。AAV血清型的实例包括天然的AAV(例如，天然的AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11，AAV12、AAV
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DJ、AAV
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DJ8、AAV
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DJ9、AAVrh8、AAVrh8R、AAVrh10、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV)和其他人工改造的AAV(例如，人工改造的AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11，AAV12、AAV
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DJ、AAV
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DJ8、AAV
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DJ9、AAVrh8、AAVrh8R、AAVrh10、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV)，优选AAV5。
[0013]在一个实施方式中，上述可变区选自VRII、VRIII、VRIV、VRV、VRVI、VRVII和VRVIII，优选VRVIII。在一个优选实施方式中，寡肽PLPSPSRL插入至AAV衣壳蛋白的N573或Q574之后，优选插入至AAV衣壳蛋白的Q574之后，更优选插入至AAV5衣壳蛋白的Q574之后。
[0014]在一个优选实施方式中，上述新型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少95％的同一性，优选上述新型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一个更优选实施方式中，上述新型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。在一个更优选实施方式中，上述新型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0015]在第二方面，本公开提供一种核酸分子，所述核酸分子编码上述新型AAV衣壳蛋白。
[0016]在一个优选实施方式中，上述核酸分子的核苷酸序列与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性，优选上述核酸分子的核苷酸序列与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
[0017]在一个优选实施方式中，上述核酸分子包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。在一个更优选实施方式中，上述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0018]在第三方面，本公开提供一种新型AAV载体，所述新型AAV载体包含上述新型AAV衣壳蛋白。
[0019]在一个优选实施方式中，上述新型AAV载体还包含异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包含编码治疗性蛋白质的核苷酸序列。在一个优选实施方式中，上述新型AAV载体还包含病毒基因组，所述病毒基因组可以是天然的AAV基因组或包含异源核酸的重组病毒基因组，所述病毒基因组可编码报告蛋白、天然蛋白、重组蛋白、抗原、抗体和/或用于核苷酸干扰(RNAi)治疗的多聚寡聚核苷酸元件(shRNA、miRNA)等。
[0020]在一个优选实施方式中，异源核酸编码一种或多种哺乳动物蛋白，或者是RNAi组分的序列(例如shRNA、siRNA、反义寡核苷酸)。在另一个优选实施方式中，异源核酸编码某些抗体、抗原、合成蛋白或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.新型AAV衣壳蛋白，其中，所述新型AAV衣壳蛋白通过在AAV衣壳蛋白的可变区插入寡肽PLPSPSRL构建而成。2.根据权利要求1所述的新型AAV衣壳蛋白，其中，所述AAV衣壳蛋白包括天然AAV衣壳蛋白和其他人工改造的AAV衣壳蛋白。3.根据权利要求2所述的新型AAV衣壳蛋白，其中，所述天然AAV选自天然的AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11，AAV12、AAV
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DJ、AAV
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DJ8、AAV
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DJ9、AAVrh8、AAVrh8R和AAVrh10，优选为天然的AAV5；所述其他人工改造的AAV选自人工改造的AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11，AAV12、AAV
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DJ、AAV
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DJ8、AAV
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DJ9、AAVrh8、AAVrh8R和AAVrh10，优选为人工改造的AAV5。4.根据权利要求1所述的新型AAV衣壳蛋白，其中，所述可变区选自VRII、VRIII、VRIV、VRV、VRVI、VRVII和VRVIII，优选VRVIII。5.根据权利要求1所述的新型AAV衣壳蛋白，其中，所述寡肽PLPSPSRL插入至AAV衣壳蛋白的N573或Q574之后，优选插入至AAV衣壳蛋白的Q574之后，更优选插入至AAV5衣壳蛋白的Q574之后。6.根据权利要求1至5中任一项所述的新型AAV衣壳蛋白，其中，所述新型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少95％的同一性，优选所述新型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列与SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵锴，杜增民，郑静，肖啸，陈晨，吴侠，蒋威，杨晨，程诚，赵阳，王利群，
申请(专利权)人：上海信致医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：