一种肽链水解试剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种肽链水解试剂及其制备方法和应用，设计了一种肽链水解试剂及其制备方法，可以用于标记和水解多肽或氨基酸；并公开了上述肽链水解试剂在氨基酸检测方法的应用，具体为：利用肽链水解试剂水解多肽或蛋白质；旋蒸，再用水溶解并将pH调至中性；加入金属螯合剂后，离心，取上清液，得到上清液的总离子质量色谱图；提取离子峰得到选择离子质量色谱图，根据水解产物的同位素二级碎片离子不相等的特性建立关系式，得到比值；分别获得多肽或蛋白质中谷氨酸和天冬氨酸的总含量，根据比值即可计算出实际含量；优点在于可以对多肽或蛋白质中的谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸这4种氨基酸进行准确定量，偏差小于10%。偏差小于10%。偏差小于10%。

A peptide chain hydrolysis reagent and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种肽链水解试剂及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于氨基酸检测领域，尤其是涉及一种肽链水解试剂及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]蛋白质在人体代谢中扮演着重要的角色，蛋白质的定量测定在食品，医学和生物学中具有重要的意义。氨基酸是既含氨基(
‑
NH2)又含羧基(
‑
COOH)的有机化合物的统称，是蛋白质或多肽水解的产物，蛋白质中的氨基酸进行定性定量分析也是蛋白质结构分析的基础。
[0003]目前蛋白质中氨基酸分析方法主要有酸水解法，碱水解法和酶法。酸水解法会造成谷氨酰胺和天冬酰胺的分解，色氨酸也会被破坏；碱性水解一般采用NaOH、KOH等强碱，但在该水解条件下谷氨酰胺，天冬酰胺，苏氨酸，丝氨酸，精氨酸和半胱氨酸均遭到破坏(龚天理，刘付芳，王卫，等.食品中氨基酸测试的发展[J].中国标准化，2018(S1):156
‑
159.)；酶水解氨基酸水解往往不彻底，反应时间长，而且引入干扰。
[0004]现行的氨基酸检测方法GB5009.124
‑
2016采用酸水解法，规定了茚三酮柱后衍生离子交换色谱仪进行食品中氨基酸的测定：将食品中的蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过可见分光光度检测器测定氨基酸的含量；但是利用酸水解法处理多肽时，谷氨酰胺和天冬酰胺，这两种具有重要营养价值和生理功能的氨基酸，会分别水解成谷氨酸(如附图1(a)所示)和天冬氨酸(如附图1(b)所示)，造成所测得的天冬氨酸和谷氨酸的实验结果有一部分是来源于天冬酰胺和谷氨酰胺，因此无法准确检测到样品中原有的谷胺酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸这四种氨基酸的真实含量，同时色氨酸在酸性条件下会被破坏，因此现行的国标法只能测定包括丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、甘氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等15种氨基酸，不能同时对含有谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸的多肽或蛋白质进行检测，因此不适用于含有谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸的多肽或蛋白质的样品的检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种肽链水解试剂、制备方法及将该肽链水解试剂用于氨基酸检测方法的应用，通过制备一种新型的肽链水解试剂，将肽链水解的同时对水解产物氨基酸进行O
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同位素标记，再利用液相色谱
‑
高分辨质谱联用下水解产物的同位素二级碎片离子不相等的特性，可以对多肽或蛋白质样品中的谷胺酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸进行检测，实现了对多种氨基酸的同时测定和准确定量。
[0006]为解决上述的技术问题，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]一种肽链水解试剂，由以下物质组成：盐酸二氧六环溶液、重水和二价金属氯化物溶液；其中，所述盐酸二氧六环溶液、所述重水和所述二价金属氯化物溶液的摩尔比为(2～
4):(35～40):(0.005～0.012)。
[0008]所述盐酸二氧六环溶液中的所述盐酸的浓度为1.7～2.2mol/L。
[0009]所述二价金属氯化物溶液中的所述二价金属离子可选自Mg
2+
,Ca
2+
,Co
2+
,Ni
2+
,Zn
2+
,Cd
2+
,Cu
2+
,Pb
2+
,Ba
2+
,Sr
2+
,Fe
2+
,Sn
2+
。
[0010]一种肽链水解试剂的制备方法，包括：
[0011]a)将盐酸二氧六环溶液和重水混匀，所述盐酸二氧六环溶液和所述重水的摩尔比为(2～4)：(35～40)，得到二氧六环盐酸重水溶液；
[0012]b)在步骤a)中的所述二氧六环盐酸重水溶液中加入二价金属氯化物溶液,所述盐酸二氧六环溶液中的所述重水溶液和所述二价金属氯化物溶液的摩尔比为(35～40):(0.005～0.012)，得到肽链水解试剂。
[0013]所述的肽链水解试剂在氨基酸检测分析的应用，具体方法为：
[0014]1)称取多肽或蛋白质样品，加入所述肽链水解试剂，冷冻、抽真空、充入惰性气体后进行加热水解；
[0015]2)充分水解后，旋蒸除去溶剂，再用水溶解并将溶液的pH调至6.5～7.5；
[0016]3)加入金属螯合剂除去二价金属氯化物中的二价金属离子，离心，得到上清液；
[0017]4)对步骤3)的所述上清液进行液相色谱
‑
高分辨质谱分析，得到所述上清液的总离子质量色谱图；
[0018]5)提取步骤4)的所述总离子质量色谱图中谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸水解产物的选择离子质量色谱图，根据所述水解产物的同位素二级碎片离子不相等的特性建立关系式，由所述关系式得到多肽或蛋白质样品中谷氨酰胺和谷氨酸的比值、天冬酰胺和天冬氨酸的比值；
[0019]6)分别获得多肽或蛋白质样品中谷氨酸和天冬氨酸的总含量，根据步骤5)得到的所述比值，即可分别计算出多肽或蛋白质样品中谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸的实际含量。
[0020]步骤1)的所述水解的温度为110℃，所述水解的时间为8～24h。
[0021]步骤3)的所述金属螯合剂与所述二价金属离子的质量比为12～24:1。
[0022]步骤5)为配制除谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸外的各个待测氨基酸的不同浓度的混合标准溶液，得到所述混合标准溶液总离子质量色谱图，提取所述混合标准溶液总离子质量色谱图中的所述各个待测氨基酸的选择离子质量色谱图，得到所述各个待测氨基酸的不同浓度对应的峰面积，分别建立所述各个待测氨基酸的峰面积与浓度的标准曲线，得到所述待测氨基酸的峰面积与浓度的线性关系式；
[0023]测量多肽或蛋白质样品的总离子质量色谱图，根据多肽或蛋白质样品的总离子质量色谱图相对应的混合标准溶液的总离子质量色谱图的色谱峰位置，获得多肽或蛋白质样品中的待测氨基酸相对应的峰面积，代入相应的所述待测氨基酸的线性关系式，得到多肽或蛋白质样品中的待测氨基酸的实际含量。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的优点在于：
[0025]本专利技术针对谷胺酰胺和天冬酰胺在强酸条件下水解为谷氨酸和天冬氨酸而导致无法对多肽和蛋白质样品中这4种氨基酸准确检测的情况，设计了一种新型的肽链水解试剂，通过制备具有特定的摩尔比的试剂，可以用于水解多肽或蛋白质，同时对水解产物氨基
酸进行标记，加入特定比例的二价金属氯化物溶液更增加了水解反应的特异性，便于后续的检测分离。
[0026]本专利技术利用设计的新型肽链水解试剂，通过液相色谱
‑
高分辨质谱联用的方法，根据反应液中谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸水解后产生的水解产物的重水同位素二级碎片离子不相等的特性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肽链水解试剂，其特征在于，由以下物质组成：盐酸二氧六环溶液、重水和二价金属氯化物溶液；其中，所述盐酸二氧六环溶液、所述重水和所述二价金属氯化物溶液的摩尔比为(2~4): (35~40): (0.005~0.012)。2.根据权利要求1所述的一种肽链水解试剂，其特征在于，所述盐酸二氧六环溶液中的所述盐酸的浓度为1.7~2.2mol/L。3.根据权利要求1所述的一种肽链水解试剂，其特征在于，所述二价金属氯化物溶液中的所述二价金属离子可选自Mg
2+
,Ca
2+
,Co
2+
,Ni
2+
,Zn
2+
, Cd
2+
,Cu
2+
,Pb
2+
,Ba
2+
,Sr
2+
,Fe
2+
,Sn
2+
。4.根据权利要求1所述的一种肽链水解试剂的制备方法，其特征在于，包括：a)将盐酸二氧六环溶液和重水混匀，所述盐酸二氧六环溶液和所述重水的摩尔比为(2~4)：(35~40)，得到二氧六环盐酸重水溶液；b)在步骤a)中的所述二氧六环盐酸重水溶液中加入二价金属氯化物溶液,所述盐酸二氧六环溶液中的所述重水溶液和所述二价金属氯化物溶液的摩尔比为(35~40): (0.005~0.012)，得到肽链水解试剂。5.权利要求1所述的肽链水解试剂在氨基酸检测分析的应用，其特征在于，具体方法为：1)称取多肽或蛋白质样品，加入所述肽链水解试剂，冷冻、抽真空、充入惰性气体后进行加热水解；2)充分水解后，旋蒸除去溶剂，再用水溶解并将溶液的pH调至6.5~7.5；3)加入金属螯合剂除去二价...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪锋，高新昌，衣大龙，
申请(专利权)人：安徽国肽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：