一种丙二酸的全生物合成的方法技术

本发明专利技术公开了一种丙二酸的全生物合成的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，模块过量表达来自大肠杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)，琥珀酸脱氢酶基因(sdhC)，琥珀酸半醛脱氢酶基因(yne1)，天门冬氨酸酶基因(aspa)，来自谷氨酸棒杆菌的异源基因天冬氨酸-α-脱氢酶基因(panD)，来自铜绿假单胞菌的异源基因β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因(pa0123)，构建了丙二酸的全生物合成途径，使工程菌成功积累丙二酸。本发明专利技术丙二酸及其前体物的生物制造具有污染少、产品质量高等优点，极具发展前景。极具发展前景。

【技术实现步骤摘要】
aspa-panD；
[0012](3)以质粒pCDFDuet-1为骨架载体，连接基因片段sdhC、ppc，得到重组质粒pCDF-sdhC-ppc；
[0013](4)将pRSF-yne1-pa0123、pTrc99a-aspa-panD、pCDF-sdhC-ppc共同转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)将基因片段pa0123及质粒pRSFDuet-1都用Nco I和Hind III双酶酶切处理后，以T
4 DNA连接酶连接得到重组质粒pRSF-pa0123；将yne1及重组质粒pRSF-pa0123都用Xho I和Nde I双酶切处理，再用T
4 DNA连接酶连接，得到重组质粒pRSF-yne1-pa0123。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)将基因片段aspa及质粒pTrc99a都用Sal I和Xho I双酶酶切处理后，以T
4 DNA连接酶连接得到重组质粒pTrc99a-aspa；将panD及重组质粒pTrc99a-aspa都用Xho I和Hind III双酶切处理，再用T
4 DNA连接酶连接，得到重组质粒pTrc99a-aspa-panD。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)将基因片段sdhC及质粒pCDFDuet-1都用Nco I和EcoR I双酶酶切处理后，以T
4 DNA连接酶连接得到重组质粒pCDF-sdhC；将ppc及重组质粒pCDF-sdhC都用EcoR I和Sal I双酶切处理，再用T
4 DNA连接酶连接，得到重组质粒pCDF-sdhC-ppc。
[0017]本专利技术的第三个目的在于提供一种应用所述重组大肠杆菌发酵生产丙二酸的方法，是以SOB培养基为发酵培养基，将重组大肠杆菌于35～37℃培养至OD
600
为0.6-0.8时加1mM IPTG并降温至30℃诱导培养48小时。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述SOB培养基的成分为2g/100ml胰蛋白胨、0.5g/100ml酵母粉、0.05g/100ml NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、0.8g/100ml葡萄糖、50μg/ml硫酸卡那霉素、50μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml链霉素。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，种子液的制备方法是将甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50ml的LB液体培养基的250ml锥形瓶中，37℃、250rpm/min摇瓶过夜。次日取1ml菌液转接于50ml LB液体培养基中，37℃、250rpm培养至OD
600
达到0.6-0.8时，转接种于50ml SOB发酵培养基中。
[0020]本专利技术还要求保护所述方法在制备丙二酸或其衍生产品方面的应用。
[0021]有益效果：与化学法相比，大肠杆菌全生物法合成丙二酸，首先以葡萄糖作为前体，可持续发展，而且极大程度地降低了对环境的污染程度。本专利技术中所提到的途径，利用葡萄糖发酵生产丙二酸是一种产量较高的途径，通过消除氰化物、氯乙酸等来提供环境效益，不需要利用其他化合物作为前提，只需过量表达来自谷氨酸棒杆菌的异源基因天冬氨酸-α-脱氢酶基因(panD)和来自铜绿假单胞菌的异源基因β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因(pa0123)这2个基因就可以利用葡萄糖合成丙二酸，方法简单，发酵工艺成熟使大肠杆菌BL21(DE3)高产丙二酸成为可能，而且此方法操作方便，成本低，发酵48小时产量可达0.23g/L。
附图说明
[0022]图1为丙二酸合成途径。
[0023]图2为pRSF-yne1-pa0123质粒图谱。
[0024]图3为pTrc99a-aspa-panD质粒图谱。
[0025]图4为pCDF-sdhC-ppc质粒图谱。
[0026]图5为pRSF-yne1-pa0123质粒菌落pcr验证图谱，1：Marker，2-5：均为pRSF-yne1-pa0123菌落pcr验证pa0123。
[0027]图6为在SOB培养基，IPTG 1mM时重组大肠杆菌发酵结果图谱。
[0028]图7为丙二酸液相质谱检测图谱；其中，(A)分别为丙二酸标样的液相图和只显示丙二酸标样的液相图；(B)分别为丙二酸标样的质谱图和只显示丙二酸的质谱图；(C)分别为发酵液样品的液相图和只显示发酵液中丙二酸的液相图；(D)分别为发酵液样品的质谱图和只显示发酵液中丙二酸的质谱图；STANDARD为1g/L标准丙二酸样品，PA为发酵液样品。
具体实施方式
[0029]丙二酸液相质谱检测及结果分析：
[0030]预处理：发酵样品12,000r/min离心2min将发酵液与菌体分离，0.22μm滤膜处理发酵液，供液相质谱检测。
[0031]液相质谱条件：检测波长：200
---
400n，分析柱：BEH C18(2.1x150mm 1.7um)，柱温45℃，流速：0.3ml/min，进样量：5μL，检测器：Waters Acquity PDA(200-400nm)。
[0032]流动相条件如下：
[0033][0034][0035]表1下述实施例涉及的引物序列表
[0036][0037]实施例1：重组质粒构建及重组大肠杆菌的获得。
[0038]ppc、sdhC、aspA、panD、pa0123和yne1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～6所示。
[0039]用Nco I和Hind III双酶切质粒pRSFDuet-1，切胶回收目的基因片段pRSF-1(3761bp)，以金唯智公司合成的质粒pUC57-pa0123为模板，用引物pa0123-F/R，PCR扩增得到目的基因片段pa0123(序列如SEQ ID NO.5所示)，然后将pRSF-1和pa0123这两个目的片段用T4DNA连接酶连接，化转JM109，菌落PCR挑取阳性转化子，并提取质粒酶切和PCR验证，验证引物是veri-pRSF-F/R,验证正确后的质粒命名为pRSF-pa0123。
[0040]用Xho I和Nde I酶切质粒pRSF-pa0123，切胶回收目的基因片段pRSF-2(5101bp)，用同样的酶酶切以大肠基因组为模板,用引物yne1-F/R，PCR扩增得到的yne1片段(如SEQ ID NO.6所示)，然后将pRSF-2和yne1这两个目的片段用T
4 DNA连接酶连接，化转JM109，菌落PCR挑取阳性转化子，并提取质粒酶切和PCR验证，验证引物是veri-pRSF-F/R,验证正确后的质粒命名为pRSF-yne1-pa0123(质粒图如图2所示)。
[0041]用Sal I和Xho I双酶切质粒pTrc99A，切胶回收目的载体DNA片段pTrc99A-1(4170bp)，用同样的酶酶切以大肠基因组为模板，用引物aspa-F/R，PCR扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产丙二酸的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，分模块过量表达来自大肠杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、琥珀酸脱氢酶基因、琥珀酸半醛脱氢酶基因、天门冬氨酸酶基因，来自谷氨酸棒杆菌的异源基因天冬氨酸-α-脱氢酶基因，来自铜绿假单胞菌的β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述分模块过量表达是将琥珀酸半醛脱氢酶基因和β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因融合表达，将天门冬氨酸酶基因和天冬氨酸-α-脱氢酶基因融合表达，将琥珀酸脱氢酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因融合表达。3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述琥珀酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述天门冬氨酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述天冬氨酸-α-脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述琥珀酸半醛脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，用于分模块过量表达的载体选自pRSFDuet-1、pTrc99a或pCDFDuet-1。5.一种构...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓禹，赵运英，李诗韵，李国辉，毛银，周胜虎，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：