Fab改造诱导形成的双特异性抗体及其制备方法和用途技术

本发明专利技术属于抗体工程领域，提供一种了Fab改造诱导形成的双特异性抗体及其制备方法和用途。本发明专利技术通过综合考虑界面氨基酸之间的各种相互作用，如静电作用、空间作用等，在抗体轻重链相互作用界面特定位置引入了氨基酸修饰，且对重链VH/CH1之间连接肽和/或轻链VL/CL之间连接肽进行了优化，使得轻重链正确配对比例提高到99％以上，并显著的降低了氨基酸修饰对突变体表达量的影响。突变体表达量的影响。突变体表达量的影响。

Bispecific antibody induced by FAB modification and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
Fab改造诱导形成的双特异性抗体及其制备方法和用途


[0001]本专利技术属于抗体工程领域，具体涉及一种Fab改造诱导形成的双特异性抗体及其制备方法和用途。

技术介绍

[0002]双特异性抗体有多种构建方式，其中IgG型双特异性抗体具有和普通抗体相似的结构、理化性质和Fc段功能。通常IgG型双特异性抗体由两条氨基酸序列不同的重链(即抗抗原A的重链HC_A和抗抗原B的重链HC_B)和两条氨基酸序列不同的轻链(即抗抗原A的轻链LC_A和抗抗原B的轻链LC_B)组成。当4条多肽链组合时，两条重链之间会形成同源二聚体和异源二聚体，轻重链之间也会形成错配，因此会产生8种不同的组合方式，其中只有一种为所需要的目标抗体分子。而从8种分子中分离纯化得到目标分子效率极低且非常困难。
[0003]抗体工程领域的进展使得IgG型双特异性抗体的制备取得了重大的进展。大多数IgG型双特异性抗体通过改造Fc段促使抗体的两条重链形成异源二聚体(Ridgway,Presta et al.1996；Carter 2001，US2010286374A1，CN106883297A，US20150307628A1)，然而，由于轻重链之间相互作用更加复杂，使得轻重链的特异性配对更加困难。具体来说，理想的状态是，构成双特异性抗体的两条重链和两条轻链中，轻链LC_A只特异性的和重链HC_A配对，而不会和重链HC_B配对，同时轻链LC_B只特异性的和重链HC_B配对，而不会和重链HC_A配对。CN104968677A；WO2016172485A2；WO2014082179A；Nat Biotechnol.2014Feb；32(2):191-8.；Protein Sci.2017Oct；26(10):2021-2038.；Protein Eng Des Sel.2017Sep 1；30(9):685-696.；公开了如何使轻重链正确配对的方法，然而本领域仍需要寻找合适的优化以进一步提高轻链配对的特异性、减少错配的副产物以及双特异性抗体的产率。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种Fab改造诱导形成的双特异性抗体及其制备方法和用途。本专利技术通过综合考虑界面氨基酸之间的各种相互作用，如静电作用、空间作用等，在抗体轻重链相互作用界面特定位置引入了氨基酸修饰，并且在重链、轻链中引入连接肽进行优化，使得轻重链正确配对比例提高到99％以上，而且显著的降低了氨基酸修饰对突变体表达量的影响。
[0005]本专利技术的第一个方面是提供一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：可与某一特异性抗原结合的重链A及与所述重链A配对的轻链a，以及可与另一特异性抗原结合的重链B及与所述重链B配对的轻链b；重链A和重链B均具有抗体重链可变区VH结构域、抗体重链恒定区CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域，轻链a和轻链b均具有抗体轻链可变区VL结构域和轻链恒定区CL结构域；重链A的VH结构域和CH1结构域之间插入连接肽、和/或重链B的VH结构域和CH1结构域之间插入连接肽、和/或轻链a的VL结构域和CL结构域之间插入连接肽、和/或轻链b的VL结构域和CL结构域之间插入连接肽；与野生型的人抗体相比，所述重链A和轻链a、重链B和轻链b具有选自下列的突变中的一种或多种：(a)VH结构域的Q39发生突
变，且VL结构域的Q38发生突变；(b)CH1结构域的L145和/或L128发生突变，且CL结构域的V133发生突变；以上所述的氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。
[0006]应当理解的是，如果存在，重链A的VH结构域和CH1结构域之间插入的连接肽、重链B的VH结构域和CH1结构域之间插入的连接肽、轻链a的VL结构域和CL结构域之间插入的连接肽、轻链b的VL结构域和CL结构域之间插入的连接肽可以是全部相同的、或部分相同的、或各不相同的。
[0007]优选地，所述连接肽长度为1-4个氨基酸。即如果存在，重链A的VH结构域和CH1结构域之间插入的连接肽长度为1-4个氨基酸；如果存在，重链B的VH结构域和CH1结构域之间插入的连接肽长度为1-4个氨基酸；如果存在，轻链a的VL结构域和CL结构域之间插入的连接肽长度为1-4个氨基酸；如果存在，轻链b的VL结构域和CL结构域之间插入的连接肽长度为1-4个氨基酸。
[0008]优选地，所述连接肽选自：G，GG，GS，SG，SS，GGG，GGS，GSG，SGG，GSS，SGS，SSG，SSS，GGGG，GGGS，GGSG，GSGG，SGGG，GGSS，SSGG，GSSG，GSGS，SGSG，SGGS，GSSS，SGSS，SSGS，SSSG，A，AA，AS，SA，SS，AAA，AAS，ASA，SAA，ASS，SAS，SSA，SSS，AAAA，AAAS，AASA，ASAA，SAAA，AASS，SSAA，ASSA，ASAS，SASA，SAAS，ASSS，SASS，SSAS，SSSA，GA，AG，GGA，GAG，AGG，GAA，AGA，AAG，GGGA，GGAG，GAGG，AGGG，GGAA，AAGG，GAAG，GAGA，AGAG，AGGA，GAAA，AGAA，AAGA，AAAG，或其他任意氨基酸的组合。
[0009]优选地，本专利技术的双特异性抗体中的所述重链A和重链B、轻链a和轻链b含有选自以下一组的突变：(1)重链A的L145突变为带正电荷氨基酸，轻链a的V133突变为带负电荷氨基酸，且重链B的L145突变为带负电荷氨基酸，轻链b的V133突变为带正电荷氨基酸；(2)重链A的L128突变为带正电荷氨基酸，轻链a的V133突变为带负电荷氨基酸，且重链B的L128突变为带负电荷氨基酸，轻链b的V133突变为带正电荷氨基酸；(3)重链A的L145突变为带正电荷氨基酸，轻链a的V133突变为带负电荷氨基酸，且重链B的L128突变为带负电荷氨基酸，轻链b的V133突变为带正电荷氨基酸；(4)重链A的L128突变为带正电荷氨基酸，轻链a的V133突变为带负电荷氨基酸，且重链B的L145突变为带负电荷氨基酸，轻链b的V133突变为带正电荷氨基酸；(5)重链A的Q39、L145突变为带正电荷氨基酸，轻链a的Q38、V133突变为带负电荷氨基酸，且重链B的Q39、L145突变为带负电荷氨基酸，轻链b的Q38、V133突变为带正电荷氨基酸；(6)重链A的Q39、L128突变为带正电荷氨基酸，轻链a的Q38、V133突变为带负电荷氨基酸，且重链B的Q39、L128突变为带负电荷氨基酸，轻链b的Q38、V133突变为带正电荷氨基酸；(7)重链A的Q39、L145突变为带正电荷氨基酸，轻链a的Q38、V133突变为带负电荷氨基酸，且重链B的Q39、L128突变为带负电荷氨基酸，轻链b的Q38、V133突变为带正电荷氨基酸；(8)重链A的Q39、L128突变为带正电荷氨基酸，轻链a的Q38、V133突变为带负电荷氨基酸，且重链B的Q39、L145突变为带负电荷氨基酸，轻链b的Q38、V133突变为带正电荷氨基酸。
[001本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含：可与某一特异性抗原结合的重链A及与所述重链A配对的轻链a，以及可与另一特异性抗原结合的重链B及与所述重链B配对的轻链b；重链A和重链B均具有抗体重链可变区VH结构域，抗体重链恒定区CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域，轻链a和轻链b均具有抗体轻链可变区VL结构域和轻链恒定区CL结构域；重链A的VH结构域和CH1结构域之间插入连接肽、和/或重链B的VH结构域和CH1结构域之间插入连接肽、和/或轻链a的VL结构域和CL结构域之间插入连接肽、和/或轻链b的VL结构域和CL结构域之间插入连接肽；与野生型的人抗体相比，所述重链A和轻链a、重链B和轻链b具有选自下列的突变中的一种或多种：(a)VH结构域的Q39发生突变，且VL结构域的Q38发生突变；(b)CH1结构域的L145和/或L128发生突变，且CL结构域的V133发生突变；以上所述的氨基酸的位置根据KABAT编号的EU索引确定。2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述连接肽长度为1-4个氨基酸，优选为：G，GG，GS，SG，SS，GGG，GGS，GSG，SGG，GSS，SGS，SSG，SSS，GGGG，GGGS，GGSG，GSGG，SGGG，GGSS，SSGG，GSSG，GSGS，SGSG，SGGS，GSSS，SGSS，SSGS，SSSG，A，AA，AS，SA，SS，AAA，AAS，ASA，SAA，ASS，SAS，SSA，SSS，AAAA，AAAS，AASA，ASAA，SAAA，AASS，SSAA，ASSA，ASAS，SASA，SAAS，ASSS，SASS，SSAS，SSSA，GA，AG，GGA，GAG，AGG，GAA，AGA，AAG，GGGA，GGAG，GAGG，AGGG，GGAA，AAGG，GAAG，GAGA，AGAG，AGGA，GAAA，AGAA，AAGA，AAAG，或其他任意氨基酸的组合。3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述重链A和重链B、轻链a和轻链b含有选自以下一组的突变：(1)重链A的L145突变为带正电荷氨基酸，轻链a的V133突变为带负电荷氨基酸，且重链B的L145突变为带负电荷氨基酸，轻链b的V133突变为带正电荷氨基酸；(2)重链A的L128突变为带正电荷氨基酸，轻链a的V133突变为带负电荷氨基酸，且重链B的L128突变为带负电荷氨基酸，轻链b的V133突变为带正电荷氨基酸；(3)重链A的L145突变为带正电荷氨基酸，轻链a的V133突变为带负电荷氨基酸，且重链B的L128突变为带负电荷氨基酸，轻链b的V133突变为带正电荷氨基酸；(4)重链A的L128突变为带正电荷氨基酸，轻链a的V133突变为带负电荷氨基酸，且重链B的L145突变为带负电荷氨基酸，轻链b的V133突变为带正电荷氨基酸；(5)重链A的Q39、L145突变为带正电荷氨基酸，轻链a的Q38、V133突变为带负电荷氨基酸，且重链B的Q39、L145突变为带负电荷氨基酸，轻链b的Q38、V133突变为带正电荷氨基酸；(6)重链A的Q39、L128突变为带正电荷氨基酸，轻链a的Q38、V133突变为带负电荷氨基酸，且重链B的Q39、L128突变为带负电荷氨基酸，轻链b的Q38、V133突变为带正电荷氨基酸；(7)重链A的Q39、L145突变为带正电荷氨基酸，轻链a的Q38、V133突变为带负电荷氨基酸，且重链B的Q39、L128突变为带负电荷氨基酸，轻链b的Q38、V133突变为带正电荷氨基酸；(8)重链A的Q39、L128突变为带正电荷氨基酸，轻链a的Q38、V133突变为带负电荷氨基酸，且重链B的Q39、L145突变为带负电荷氨基酸，轻链b的Q38、V133突变为带正电荷氨基酸。4.根据权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于，所述带正电荷氨基酸指K或R，所述带负电荷氨基酸指D或E，所述重链A和重链B、轻链a和轻链b含有选自以下一组的突变：
1)重链A：L145K或L145R，轻链a：V133D或V133E，且重链B：L145D或L145E，轻链b：V133K或V133R；2)重链A：L128K或L128R，轻链a：V133D或V133E，且重链B：L128D或L128E，轻链b：V133K或V133R；3)重链A：L145K或L145R，轻链a：V133D或V133E，且重链B：L128D或L128E，轻链b：V133K或V133R；4)重链A：L128K或L128R，轻链a：V133D或V133E，且重链B：L145D或L145E，轻链b：V133K或V133R；5)重链A：(Q39K或Q39R)+(L145K或L145R)，轻链a：(Q38D或Q38E)+(V133D或V133E)，且重链B：(Q39D或Q39E)+(L145D或L145E)，轻链b：(Q38K或Q38R)+(V133K或V133R)；6)重链A：(Q39K或Q39R)+(L128K或L128R)，轻链a：(Q38D或Q38E)+(V133D或V133E)，且重链B：(Q39D或Q39E)+(L128D或L128E)，轻链b：(Q38K或Q38R)+(V133K或V133R)；7)重链A：(Q39K或Q39R)+(L145K或L145R)，轻链a：(Q38D或Q38E)+(V133D或V133E)，且重链B：(Q39D或Q39E)+(L128D或L128E)，轻链b：(Q38K或Q38R)+(V...

【专利技术属性】
技术研发人员：周易，
申请(专利权)人：周易，
类型：发明
国别省市：