一种细菌光热检测试剂、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术属于微生物检测技术领域，具体涉及一种细菌光热检测试剂、试剂盒及检测方法。将MPBA功能化至AuNPs表面，MPBA包含两个官能团：可与Au结合的巯基基团，以及与细菌细胞壁中的肽聚糖共价结合的硼酸基团。当体系不存在细菌时，继续添加过量的MPBA可以通过形成环酯选择性地结合顺式二醇基团，引起MPBA‑AuNPs聚集，使溶液从红色转变为蓝色。而当体系中存在细菌时，将MPBA‑AuNPs固定在细菌表面，过量的MPBA引起AuNPs聚集不明显。由于聚集的和未聚集状态的AuNPs的光热转换效率不同，经激光器照射后，溶液产生的温度变化不同，通过普通数字温度计检测温度变化即可定量转化为对应细菌浓度。

【技术实现步骤摘要】
一种细菌光热检测试剂、试剂盒及检测方法
本专利技术属于微生物检测
，具体涉及一种细菌光热检测试剂、试剂盒及检测方法。
技术介绍
微生物的快速检测在食品安全、水环境监测、公共安全和医疗诊断等方面具有重要意义。传统的微生物检测的方法主要包括培养法、聚合酶链式反应（PCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等，但这些方法往往具有耗时、灵敏度低和特异性差或者需要专业的设备和专业人员的弊端。而近年来，随着生命科学、物理学、分析化学、纳米科学以及信息科学和其他相关技术的发展，基于纳米材料的比色法在分析检测领域引起了极大的关注，但比色法的信号读取方式分为两种，一种基于肉眼的颜色判断，灵敏度较低；另一种需借助酶标仪或分光光度计，依赖于大型仪器的方式无法满足床旁检测简便、即时的需求。基于便携式温度计的生物传感器在快速检测得到广泛讨论，但其在微生物检测领域应用较少，且已有的基于温度计的微生物检测方法操作繁琐。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种细菌光热检测试剂、试剂盒及检测方法。本专利技术的第一方面，提供一种细菌光热检测试剂，其包含巯基苯硼酸（MPBA）修饰的纳米金颗粒。其中，MPBA具体可选择4-MPBA或3-MPBA。进一步的，MPBA修饰的纳米金颗粒的制备为：用柠檬酸盐还原法合成胶体金纳米颗粒，得到柠檬酸根阴离子稳定的胶体金纳米颗粒混合体系，然后加入MPBA反应，得到MPBA修饰的纳米金颗粒。进一步的，所加入的MPBA浓度为0.04mM，加入MPBA后反应时间为20min。本专利技术的第二方面，提供一种细菌光热检测试剂盒，其包含试剂一、试剂二、激光器、温度检测装置；所述试剂一为如上所述的细菌光热检测试剂；所述试剂二包含MPBA。进一步的，所述激光器可形成照射功率为1W/cm2的激光。本专利技术的第三方面，提供一种细菌光热检测方法，包括以下步骤：（1）将如权利要求1-3任一项所述的细菌光热检测试剂与待测溶液反应；（2）在步骤（1）反应结束后的体系中加入MPBA，进行反应；（3）将步骤（2）反应结束后的体系用激光照射，并使用温度检测装置监测温度变化。进一步的，步骤（1）中，反应的时间为15-45min。进一步的，步骤（2）中，MPBA加入的浓度为0.5mM，反应时间为30min。进一步的，步骤（3）中，激光照射采用激光器照射功率的1W/cm2，照射时间3min。本专利技术的有益效果如下：本专利技术将MPBA功能化至AuNPs表面，MPBA包含两个官能团：可与Au结合的巯基基团，以及与细菌细胞壁中的肽聚糖共价结合的硼酸基团。当体系不存在细菌时，继续添加过量的MPBA（50μM）可以通过形成环酯选择性地结合顺式二醇基团，中和斥力从而引起MPBA-AuNPs聚集，使溶液从红色转变为蓝色。而当体系中存在细菌时，MPBA-AuNPs将通过共价键与细菌细胞壁上存在的多糖的顺式-二醇基团结合，从而将MPBA-AuNPs固定在细菌表面，过量的MPBA引起AuNPs聚集不明显。由于聚集的和未聚集状态的AuNPs的光热转换效率不同，经激光器照射后，溶液产生的温度变化不同，通过普通数字温度计检测温度变化即可定量转化为对应细菌浓度。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本专利技术的范畴。图1为基于4-MPBA诱导纳米金聚集的细菌光热检测原理图；图2为4-MPBA诱导纳米金聚集体系的可行性验证；（A）-（D）分别为4-MPBA-AuNPs、4-MPBA-AuNPs+E.coliO157:H7、4-MPBA-AuNPs+过量4-MPBA和4-MPBA-AuNPs+E.coliO157:H7+过量4-MPBA的透射电镜图像（TEM）；（E）为经激光照射后对应温度上升值图像；（F）为UV-vis中吸光度的变化；图3为基于4-MPBA诱导纳米金聚集体系反应条件的优化；激光器照射功率（A）和时间（B），4-MPBA功能化浓度和时间（C），细菌与4-MPBA-AuNPs体系孵育时间（D），过量4-MPBA聚集浓度（E）及时间（F）；图4为大肠杆菌的检测性能。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一步地详细描述。以下实施例中所使用的材料及来源如下：氯金酸购自上海麦克林生化科技有限公司。柠檬酸三钠和4-巯基苯硼酸购自Sigma-Aldrich（美国）。碳酸氢铵购自阿拉丁化学有限公司。实验用水均为超纯水，电导率为18.2MΩcm。以下实施例中所使用的仪器如下：多功能酶标仪（SpectraMaxiD3，美谷分子仪器有限公司，上海）、高速冷冻离心机（5417R型，Eppendorf，德国）、集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S型，上海力辰邦西仪器科技有限公司）、红外光热检测平台（MW-GX-660/2000MW，长春镭仕光电科技有限公司），紫外可见光谱分析仪（凌析V-3000，上海凌析仪器有限公司）、便携式温度计（榛利GL637，福州榛利机光电科技有限公司）、JEM-2100F高分辨透射电子显微镜（JEM-2100F，日本东京）等。实施例1：4-MPBA-AuNP的合成胶体金纳米颗粒用柠檬酸盐还原法合成，具体过程如下：在剧烈搅拌下，通过油浴将100mLHAuCl4（0.01％w/w）溶液加热至120℃，然后将10mL38.8mM柠檬酸三钠快速加入上述溶液中。溶液的颜色从浅黄色变为无色，最后呈酒红色，持续加热15分钟后停止加热，继续搅拌至溶液冷却至室温（〜2h）。通过在4℃下以5,000rpm离心30分钟获得产物，并将其重新分散在缓冲溶液（10mMNH4HCO3）中，得到柠檬酸根阴离子稳定的AuNPs混合体系，4°C保存备用。将4-MPBA（0.004mM）添加到柠檬酸根阴离子稳定的AuNPs混合体系中，制备4-MPBA-AuNPs。实施例2：利用AuNPs的光热效应进行细菌检测实验所用的大肠杆菌O157：H7（E.coliO157：H7）为本实验室保存菌株，使用Luria-Bertani（LB）液体培养基（胰蛋白胨1%，氯化钠1%，酵母提取物0.5%，水100mL）培养，单个菌落在恒温摇床下（250rpm，37℃）培养至对数期（6-12h）。然后，以4000rpm离心5分钟，去离子水洗涤三次，使用缓冲溶液（10mMNH4HCO3）将细菌稀释至不同浓度（101-109cfu/mL）。将1mL新制备的4-MPBA-AuNPs溶液与不同浓度的大肠杆菌混合，在室温下反应适当的时间（30min）。然后，通过添加过量的4-MPBA（0.05mM）以诱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细菌光热检测试剂，其特征在于：其包含MPBA修饰的纳米金颗粒。/n

【技术特征摘要】
1.一种细菌光热检测试剂，其特征在于：其包含MPBA修饰的纳米金颗粒。


2.根据权利要求1所述的细菌光热检测试剂，其特征在于：MPBA修饰的纳米金颗粒的制备为：用柠檬酸盐还原法合成胶体金纳米颗粒，得到柠檬酸根阴离子稳定的胶体金纳米颗粒混合体系，然后加入MPBA反应，得到MPBA修饰的纳米金颗粒。


3.根据权利要求2所述的细菌光热检测试剂，其特征在于：所加入的MPBA浓度为0.04mM，加入MPBA后反应时间为20min。


4.一种细菌光热检测试剂盒，其特征在于：其包含试剂一、试剂二、激光器、温度检测装置；
所述试剂一为如权利要求1-3任一项所述的细菌光热检测试剂；
所述试剂二包含MPBA。


5.根据权利要求4所述的细菌光热检测试剂盒，其特征在于：所述激光...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑来宝，董雯佳，楼永良，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33