一种基于纳米孔测序平台的新城疫病毒疫苗株系鉴定及突变检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于纳米孔测序平台的新城疫病毒(NDV)疫苗文库构建方法、全基因组测定的方法及应用，属于动物疫苗病毒株系鉴定及突变检测等疫苗质量安全监管检测领域。本发明专利技术所提供的基于纳米孔测序平台的文库的构建方法包括：对来自于NDV减毒活疫苗的核酸富集，所述减毒活疫苗的核酸类型为RNA。所提供的鉴定微生物的方法包括：利用纳米孔测序平台对上述测序文库进行测序，以便获得测序结果；将所述测序结果与参考数据库进行比对，基于比对结果确定疫苗病毒株系。这种纳米孔实时检测技术不仅可以实时、实地检测NDV疫苗株的基因组序列，而且可以利用生物信息学软件快速筛查潜在变异位点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于纳米孔测序平台的新城疫病毒疫苗株系鉴定及突变检测方法及应用
本专利技术涉及动物疫苗病毒株系鉴定及突变检测等疫苗质量安全监管检测领域，具体涉及一种基于纳米孔测序平台的新城疫病毒减毒活疫苗全基因组序列文库构建、鉴定突变位点的方法及应用。
技术介绍
新城疫病毒(NDV)在病毒分类学中的位置属于分子负链RNA目(Mononegavirales)、副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)、禽腮腺炎病毒或禽副黏病毒属(Avulavirus)。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。新城疫病的免疫防治，以预防接种为主要措施。接种用的疫苗有两大类，一类为灭活疫苗，另一类为减毒活疫苗。减毒活疫苗是指病原体经过各种处理后，发生变异，毒性减弱，但仍保留其免疫原性。将其接种到身体内，不会引起疾病的发生，但病原体可在机体内生长繁殖，引发机体免疫反应，起到获得长期或终生保护的作用。减毒活疫苗的优点有：使用的是活的微生物，可在机体内长时间起作用、而诱导较强的免疫反应；活的微生物有再增殖的特性，理论上只需接种一次，即可以达到满意的免疫效果。然而减毒活疫苗在使用过程中仍然存在一系列的隐患，包括1.一般减毒活疫苗均保留一定残余毒力，对一些个体(如免疫缺陷者)可能诱发严重疾病。2.由于种种原因(如基因修饰等)，减毒活疫苗有可能出现"毒力返祖"现象。3.是活微生物制剂，可能造成环境污染、而引发交叉感染等。同时由于各疫苗公司毒种来源、建库方式、细胞基质及生产工艺等各不相同，疫苗病毒序列虽然非常相似，但仍存在一定的差异，不同批次之间也有差异，因此建立快速测定动物减毒活疫苗的方法，对于此类疫苗的安全使用和有效监管均具有重要意义。目前对于动物减毒活疫苗序列测定方法主要依赖第一代测序技术sanger测序法和第二代测序技术NGS测序方法，然而这两种方法在弱毒动物疫苗的序列测定过程中存在诸多缺陷。首先，基于sanger测序法的序列测定虽然测序准确度高，但存在测序通量低及实验周期长的缺点。而二代宏基因组测序整体检测周期长，往往需要1～3天时间。检测所需数据量大，检测成本较高，仅能在专业检测公司或者大型中心实验室开展。纳米孔测序技术是基于核酸分子通过纳米孔时电势差变化而进行碱基检测的单分子测序技术。与已有测序技术不同的是，纳米孔测序技术没有DNA合成这一步骤，是目前唯一可以对核酸分子直接进行测序的技术。同时纳米孔测序还兼具超长读长、便携且可实时测序、高通量多平台等其他测序平台不具有的优势。但是其试剂成本相比较于二代测序高5～10倍，同时由于缺少针对NDV减毒活疫苗的生物信息分析流程导致该技术在实际中很难普及，需要进一步改进。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于纳米孔测序平台的NDV减毒活疫苗文库构建方法及全长基因组测定及突变位点预测的方法。首先，本专利技术提供了一种基于纳米孔测序平台的新城疫病毒疫苗株核酸文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)NDV减毒活疫苗的核酸提取；2)利用RT-PCR合成双链DNA；反转录获得样品的cDNA，以此为模板进行PCR扩增，利用NDV全长扩增引物池对病毒全长序列进行分段扩增；所述的NDV全长扩增引物池包括SEQIDNO.1-SEQIDNO.28所示的引物序列；3)对步骤2)富集的双链DNA进行定量和稀释，对获得的DNA片段进行平末端修复，进行接头连接，接头连接产物纯化。作为本专利技术的优选方案，所述的步骤2)中，反转录引物使用随机引物RandomN6。作为本专利技术的优选方案，所述的步骤2)中，PCR体系如下：PCR反应程序如下：98℃预变性2min；98℃10s，56℃10s，68℃1min，30个循环,；68℃延伸5min。作为本专利技术的优选方案，所述的NDV减毒活疫苗的株系包括B1、Lasota及Clone30株系。其次，本专利技术还提供了一种鉴定NDV疫苗株种类的方法，其包括如下步骤：1)基于待测样本核酸，获得测序文库；2)基于所述测序文库，利用纳米孔测序平台进行测序，获得测序结果；3)将所述测序结果与参考NDV病毒数据库进行比对，基于比对结果确定所述待测样本中的病毒株系种类；所述参考数据库为RefSeq病毒数据库。作为本专利技术的优选方案，所述的步骤2)获得测序结果后，还包括数据前处理步骤，具体包括：将电信号转换成碱基信号；过滤掉测序中产生的接头序列或者低质量片段。作为本专利技术的优选方案，所述的步骤3)具体为：前处理后的测序结果与参考数据库进行比对，筛选比对质量值大于50且测序片段80％部分均可比对上参考序列的比对数据值，按照比对结果，鉴定病毒的种类或者株系类型。再者，本专利技术还提供了一种预测病毒突变位点的方法，其包括：1)基于待测样本核酸，获得测序文库；2)基于所述测序文库，利用纳米孔测序平台进行测序，获得测序结果；3)将所述测序结果与参考NDV病毒数据库进行比对，基于比对结果确定所述待测样本中的病毒株系；基于比对结果预测所述待测样本中的病毒突变位点；所述参考数据库为RefSeq病毒数据库。作为本专利技术的优选方案，所述的步骤3)中，预测所述待测样本中的病毒突变位点的筛选标准为：平均位点测序覆盖深度必须大于10且碱基质量测序平均质量值大于等于14。最后，本专利技术提供了一种试剂盒，其包含NDV引物池，所述引物池包括SEQIDNO.1-SEQIDNO.28所示的引物序列。与现有技术相比，本专利技术有益效果如下：1)本专利技术适用于NDV减毒活疫苗序列的检测与突变位点的分析；2)本专利技术方法可以实时检测实时分析，达到快速、现场检测的目的，理性情况下1分钟内的数据分足够实现病毒全基因组100％覆盖；3)本专利技术本地数据库的建立和生物信息方法的建立，为快速检测提供软件支持；鉴于本专利技术的这些优点，它可被用于但不限于NDV减毒活疫苗全长基因组测定并疫苗生产质量控制具有重要意义。附图说明图1展示了本方法的文库构建、上机测序及生物信息学分析流程。图2代表引物池中不同引物以及对应扩增片段在NDV基因组上的分布。图3表示利用不同引物对扩增得到的病毒基因组片段跑胶图，序列长度在1k左右。图4表示测序结束后，不同扩增片段在基因组上的覆盖度。图5表示疫苗病毒序列可能存在的基因变异位点。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。下述实施例和实验例涉及的仪器包括：MinION测序仪、高速离心机、Qubit3.0、金属浴、移液器、磁本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于纳米孔测序平台的新城疫病毒疫苗株核酸文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/n1)NDV减毒活疫苗的核酸提取；/n2)利用RT-PCR合成双链DNA；/n反转录获得样品的cDNA，以此为模板进行PCR扩增，利用NDV全长扩增引物池对病毒全长序列进行分段扩增；所述的NDV全长扩增引物池包括SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.28所示的引物序列；/n3)对步骤2)富集的双链DNA进行定量和稀释，对获得的DNA片段进行平末端修复，进行接头连接和接头连接产物纯化。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于纳米孔测序平台的新城疫病毒疫苗株核酸文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)NDV减毒活疫苗的核酸提取；
2)利用RT-PCR合成双链DNA；
反转录获得样品的cDNA，以此为模板进行PCR扩增，利用NDV全长扩增引物池对病毒全长序列进行分段扩增；所述的NDV全长扩增引物池包括SEQIDNO.1-SEQIDNO.28所示的引物序列；
3)对步骤2)富集的双链DNA进行定量和稀释，对获得的DNA片段进行平末端修复，进行接头连接和接头连接产物纯化。


2.根据权利要求1所述的基于纳米孔测序平台的新城疫病毒疫苗株核酸文库构建方法，其特征在于，所述的步骤2)中，反转录引物使用随机引物RandomN6。


3.根据权利要求1所述的基于纳米孔测序平台的新城疫病毒疫苗株核酸文库构建方法，其特征在于，所述的步骤2)中，PCR体系如下：



PCR反应程序如下：98℃预变性2min；98℃10s，56℃10s，68℃1min，30个循环；68℃延伸5min。


4.根据权利要求1所述的基于纳米孔测序平台的新城疫病毒疫苗株核酸文库构建方法，其特征在于，所述的NDV减毒活疫苗的株系包括B1、Lasota及Clone30株系。


5.一种鉴定NDV疫苗株种类的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)基于待测样本核酸，根据权利要求1-3任一项所述的方法获得测序文库；
2)基于所述测序文库，利用纳米孔测序平台进行测序，获得测序结果；
3)将...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹传林，孙凯，俞晓平，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33