一种获得已知TDNA侧翼序列插入基因组位点的方法技术

本发明专利技术属于转基因技术领域，具体公开了一种获得已知TDNA侧翼序列插入基因组位点的方法。本发明专利技术通过农杆菌转化法得到转基因植株，插入植物基因组的部分为转基因载体上LB到RB区间的部分，通过已知的TDNA侧翼序列中的LB—RB区间得到插入位置附近植物基因组序列信息，从而得到转基因插入基因组的位置信息；另外，本发明专利技术不需要繁琐的实验过程以及大量的测序分析，就可得到基因组序列信息，通过一次PCR程序即可完成特异性片段的富集，在一代测序的少量数据中即可分析得到插入位置的信息，简单高效，具有一定的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种获得已知TDNA侧翼序列插入基因组位点的方法
本专利技术属于转基因
，具体涉及一种获得已知TDNA侧翼序列插入基因组位点的方法。
技术介绍
转基因检测过程中，常用PCR技术检测目的基因是否存在，一般使用southern杂交检测目的基因的拷贝数，用qPCR技术检测目的基因的转录情况，用TailPCR鉴定目标基因在基因组中的插入情况等；通过对插入基因组位点进行分析，人们可以判断不同的转基因株系，以及转基因的纯合和杂合情况，也更容易跟踪目标基因的情况，所以插入位点的鉴定是转基因植物产业化应用所必须的。根据目前农杆菌转化技术的原理，外源基因在基因组中的插入位点是随机的，在每一次转化事件中，外源基因在基因组中的侧翼序列是独特的，因此，可以通过检测侧翼序列来区分不同的转基因株系。目前已有文献报道了玉米、油菜、大豆、水稻等转基因作物转化事件的具体检测方法，这种检测方法为转基因作物的育种、生产、加工和销售提供可靠的技术支持。文献(刘东波,邢国杰,赵倩倩,等.抗病毒转基因大豆事件外源T-DNA序列分析及定性检测[J].大豆科学,2020(1))中，作者通过IlluminaXten平台，对大豆进行全基因组测序(wholegenomesequencing,WGS)，并结合生物信息学分析和PCR技术对转基因事件的旁侧序列进行了分析，通过全基因组测序，并与大豆参考基因组(Wm82.a2.v1)和转化载体序列做比较，初步找到插入序列T-DNA的边界及其旁侧序列，结果证明了全基因组测序在识别转基因作物T-DNA插入和旁侧序列区域方面的有效性和稳定性。文献(魏岁军,邓力华,肖国樱.转基因水稻EB7001S事件特异性检测方法的建立[J].农业生物技术学报,2014,22(5):621-631.)中，作者利用利用高效热不对称PCR(highefficientthermalasymmetricinterlacedPCR，hiTAIL—PCR)和长距离PCR法(10ng—distancePCR，LD—PCR)扩增获得了转基因水稻EB7001S中外源基因插入位点的旁侧序列，此方法特异性较强、稳定性好、灵敏度高，在模板中掺入EB7001S基因组DNA的量为0.1％时仍可以通过普通PCR方法检测出来。以往的研究方法所提供的都是经过大量的pcr实验以及高通量测序来分析外源T-DNA的插入，尽管结果特异性高，准确性高，但过程复杂，耗费大量的人力物力。为了分析转基因表达载体转入植株后，在植物基因组中的插入情况以及对植物基因组的影响，本研究提供一种新型的分析方法，不需要繁琐的实验过程以及大量的测序分析，就可得到基因组序列信息。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种获得已知TDNA侧翼序列插入基因组位点的方法。通过农杆菌转化法得到转基因植株，插入植物基因组的部分为转基因载体上LB到RB区间的部分，通过已知的TDNA侧翼序列中的LB—RB区间得到插入位置附近植物基因组序列信息，从而得到转基因插入基因组的位置信息。本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种获得已知TDNA侧翼序列插入基因组位点的方法，包括如下步骤：S1、通过农杆菌介导法，将包含有已知TDNA侧翼序列的载体转化到植株中，获得转基因阳性苗；S2、在所述已知TDNA侧翼序列的RB端找到一个4碱基酶切位点和/或6碱基酶切位点；S3、提取所述转基因阳性苗的基因组DNA，选择4碱基酶切位点和/或6碱基酶切位点的限制性内切酶对所述基因组DNA进行酶切操作，获得不同长度的基因片段；S4、使用DNA连接酶对所述基因片段进行酶连操作，获得成环片段；根据所述酶切位点的右侧序列并设计一对特异性的引物对成环的片段进行扩增，向两端反向延长连成线性片段；S5、对所述线性片段进行回收、纯化后，送一代测序，将获得的测序结果与数据库中基因组数据进行比对，即可获得已知TDNA侧翼序列插入基因组位点信息。进一步地，步骤S2中，所述已知TDNA侧翼序列的RB端序列如SEQIDNO:2所示。进一步地，步骤S2中，所述4碱基酶切位点为Tail酶切位点。进一步地，步骤S2中，所述6碱基酶切位点为HindⅢ酶切位点。进一步地，步骤S3中，所述Tail酶切位点具体酶切反应过程如下：加入8μL基因组DNA、1μL10×酶切buffer、1μLTail内切酶，在65℃的条件下反应4h，之后在80℃的条件下加热失活。进一步地，步骤S3中，所述HindⅢ酶切位点具体酶切反应过程如下：加入8μL基因组DNA、1μL10×酶切buffer、1μLHindⅢ内切酶，在37℃的条件下反应4h，之后在80℃的条件下加热失活。进一步地，步骤S4中，所述酶连反应过程如下：加入10μL酶切产物、1μLT4连接酶、1μL10×连接酶buffer，在16℃的条件下反应5h，之后在4℃的条件下保存。进一步地，步骤S4中，所述特异性的引物序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。本专利技术中，在包含有已知TDNA侧翼序列的载体的一侧，靠近两臂端点位置寻找一个酶切位点，若为4碱基酶切位点，那么44＝256bp必然有一次重复；若为6碱基酶切位点，那么46＝4096bp必然有次重复，所以对应的在基因组上也会存在同样的酶切位点。在T-DNA右臂序列上，选取一个4碱基酶切位点TaiI/MaeI[acgt]，一个6碱基酶切位点HindIII[aagctt]，然后提取转基因植株基因组DNA，进行酶切，会产生三种线性片段：载体序列，载体+基因组，基因组。用连接酶连接起来成环，预期得到的环是含有一部分已知载体RB端序列信息和一部分期望得到的插入位置附近的基因组信息，在已知序列附近设计两条引物，朝两个方向扩增，把环状片段扩增成两端是已知序列的线性片段，对扩增产物进行一代测序，即可得到转基因插入位点附近的基因组信息。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：1)本专利技术通过农杆菌转化法得到转基因植株，插入植物基因组的部分为转基因载体上LB到RB区间的部分，通过已知的TDNA侧翼序列中的LB—RB区间得到插入位置附近植物基因组序列信息，从而得到转基因插入基因组的位置信息；2)本专利技术不需要繁琐的实验过程以及大量的测序分析，就可得到基因组序列信息，通过一次PCR程序即可完成特异性片段的富集，在一代测序的少量数据中即可分析得到插入位置的信息，简单高效，具有一定的应用前景。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实验原理图；图2为本专利技术酶切电泳检测图；其中，Tail(1)：用Tail限制性内切酶，酶切buffer和连接酶buffer同时加入；Tail(2)：用Tail限制性内切酶，酶切buffer和连本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种获得已知TDNA侧翼序列插入基因组位点的方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、通过农杆菌介导法，将包含有已知TDNA侧翼序列的载体转化到植株中，获得转基因阳性苗；/nS2、在所述已知TDNA侧翼序列的RB端找到一个4碱基酶切位点和/或6碱基酶切位点；/nS3、提取所述转基因阳性苗的基因组DNA，选择4碱基酶切位点和/或6碱基酶切位点的限制性内切酶对所述基因组DNA进行酶切操作，获得不同长度的基因片段；/nS4、使用DNA连接酶对所述基因片段进行酶连操作，获得成环片段；根据所述酶切位点的右侧序列并设计一对特异性的引物对成环的片段进行扩增，向两端反向延长连成线性片段；/nS5、对所述线性片段进行回收、纯化后，送一代测序，将获得的测序结果与数据库中基因组数据进行比对，即可获得已知TDNA侧翼序列插入基因组位点信息。/n

【技术特征摘要】
1.一种获得已知TDNA侧翼序列插入基因组位点的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、通过农杆菌介导法，将包含有已知TDNA侧翼序列的载体转化到植株中，获得转基因阳性苗；
S2、在所述已知TDNA侧翼序列的RB端找到一个4碱基酶切位点和/或6碱基酶切位点；
S3、提取所述转基因阳性苗的基因组DNA，选择4碱基酶切位点和/或6碱基酶切位点的限制性内切酶对所述基因组DNA进行酶切操作，获得不同长度的基因片段；
S4、使用DNA连接酶对所述基因片段进行酶连操作，获得成环片段；根据所述酶切位点的右侧序列并设计一对特异性的引物对成环的片段进行扩增，向两端反向延长连成线性片段；
S5、对所述线性片段进行回收、纯化后，送一代测序，将获得的测序结果与数据库中基因组数据进行比对，即可获得已知TDNA侧翼序列插入基因组位点信息。


2.如权利要求1所述的获得已知TDNA侧翼序列插入基因组位点的方法，其特征在于，步骤S2中，所述已知TDNA侧翼序列的RB端序列如SEQIDNO:2所示。


3.如权利要求1所述的获得已知TDNA侧翼序列插入基因组位点的方法，其特征在于，步骤S2中，所述4碱基酶切位点为Tail酶切位点。


4.如权利要求1所述的获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：李阳，张越，
申请(专利权)人：武汉伯远生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42