一种酿酒酵母表达重组鸡硫氧还蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种重组鸡硫氧还蛋白及其制备方法，包括以下步骤：(1)酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT‑MFα‑rChTRX‑His的构建；(2)pYES2/CT‑MFα‑rChTRX‑His工程菌的制备、转化；(3)含有pYES2/CT‑MFα‑rChTRX‑His的酿酒酵母工程菌的摇瓶培养、诱导表达纯化及检定。本发明专利技术制备工程菌中ChTRX基因具有酿酒酵母偏爱型特点，并含有酿酒酵母信号肽，可使ChTRX分泌表达，并且大大提高了表达产物的产量，相比大肠杆菌表达系统和其他有益菌分泌表达系统而言，获取工艺简单，成本更低。

【技术实现步骤摘要】
一种酿酒酵母表达重组鸡硫氧还蛋白及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种酿酒酵母表达重组鸡硫氧还蛋白的制备方法。
技术介绍
硫氧还蛋白(Thioredoxin,TRX)是一类高度保守的低分子量蛋白质，在细胞内可溶性、对热稳定、具有氧化还原活性的酸性小分子蛋白质，分子量约为12kDa。TRX广泛分布于植物、细菌、酵母和动物中，它与硫氧还蛋白还原酶(TR)、还原型烟酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)三者共同组成硫氧还蛋白系统(TRX系统)，是一个有效的蛋白还原系统。TRX在其保守的活化区域内含有二硫巯基和二硫键，其氧化还原活性使硫氧还蛋白具有维持体内稳定的氧化还原状态、调节细胞生长、抑制凋亡、调节基因转录影响蛋白在动物体内的含量、免疫调节等功能。根据相关文献报道，鸡硫氧还蛋白的获取方式主要有动物内脏提取纯化、动物体内诱导和原核诱导表达的方式。动物内脏提取法依赖于动物组织的供给，不能规模化生产。如果采用原核表达和真核表达，该系统存在容易形成包涵体、获得的蛋白生物学活性较低等缺陷；而采用毕赤酵母表达则需用甲醇诱导，表达产物不能直接用作于养殖业，需要提纯后才能利用，生产成本高，因此选择酿酒酵母真核表达系统对鸡硫氧还蛋白进行外源表达。
技术实现思路
为克服
技术介绍
中的问题，本专利技术提供了一种制备的重组鸡硫氧还蛋白的方法，包含以下步骤：(1)酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT-MFα-rChTRX-His的构建，具体包括：鸡硫氧还蛋白基因的人工优化，以获得质粒pMD19-T-rChTRX-His；对质粒pYES2/CT-MFα及以上胶回收的rChTRX-His片段进行双酶切，获得阳性克隆pYES2/CT-MFα-rChTRX-His；(2)pYES2/CT-MFα-rChTRX-His工程菌的制备、转化，具体包括：酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制；将步骤(1)获得的pYES2/CT-MFα-rChTRX-His以及pYES2/CT-MFα质粒分别转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养基的培养及PCR扩增、筛选，获得阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-MFα-rChTRX-His)；(3)含有pYES2/CT-MFα-rChTRX-His的酿酒酵母工程菌的摇瓶培养、诱导表达纯化及检定，具体包括：将步骤(2)获得的阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-MFα-rChTRX-His)，通过培养、离心、收集上清液经过柱层析，得纯化后的上清蛋白液，经SDS-PAGE电泳以及鼠抗His单克隆抗体经Westernblot鉴定，均可观察到特异性条带，即为本专利技术获得的酿酒酵母表达重组鸡硫氧还蛋白。进一步的，所述步骤(1)中，鸡硫氧还蛋白基因的人工优化，以获得质粒pMD19-T-rChTRX-His，具体步骤为：根据鸡硫氧还蛋白氨基酸序列以及酿酒酵母对密码子的偏爱性，人工设计了酿酒酵母偏爱型重组鸡硫氧还蛋白基因，重组鸡硫氧还蛋白核苷酸序列为序列表1所示，重组鸡硫氧还蛋白氨基酸序列为序列表2所示；将重组鸡硫氧还蛋白基因以ChTRX-His的顺序插入pMD19-TSimpleVector的HindⅢ酶切位点和XbaⅠ酶切位点之间，其5’端HindⅢ酶切位点，3’端接XbaⅠ酶切位点，由此得到质粒pMD19-T-rChTRX-His。进一步的，所述步骤(1)中，对质粒pYES2/CT-MFα及以上胶回收的rChTRX-His片段进行双酶切，获得阳性克隆pYES2/CT-MFα-rChTRX-His，具体步骤为：根据rChTRX-His基因的序列设计合成正向引物rChTRX-HisF和反向引物rChTRX-HisR，通过PCR扩增pMD19-T-rChTRX-His质粒中rChTRX-His基因，按照凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收；用QuickCutNotI和QuickCutXbaI分别对购买的质粒pYES2/CT-MFα及以上胶回收的rChTRX-His片段进行双酶切，并分别切胶回收rChTRX-His基因片段和pYES2/CT-MFα片段，然后用T4DNA连接酶进行连接得重组质粒，将重组质粒转化至大肠杆菌(DH5ɑ)，在含氨苄霉素的LB平板培养基上挑取阳性克隆，经菌液PCR(正向引物：rChTRX-HisF；反向引物：rChTRX-HisR)及双酶切(QuickCutNotI和QuickCutXbaI)鉴定，选取阳性克隆pYES2/CT-MFα-rChTRX-His。进一步的，所述步骤(2)中，酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制，具体方法为：YPD培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g(制备固体培养基时另加20g琼脂粉)，溶于800ml水中，定容到1L，121℃高压灭菌20min；SC-U液体培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，加去离子水900ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用；SC-U平板培养基，6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，20g琼脂粉，加去离子水900ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用；SC-U诱导培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，加去离子水800ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液和100ml过滤除菌的20％半乳糖溶液，混匀，4℃保存备用。进一步的，所述步骤(2)中，获得阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-MFα-rChTRX-His)的具体步骤为：将10μlpYES2/CT-MFα-rChTRX-His质粒加到80μl酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中，冰浴5min，将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，PIC选项，电击杯置于Bio-Rad电转化仪上电击，同时迅速向电击杯中加入500μl预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC-U平板培养基，30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆菌落，单克隆菌落中含有pYES2/CT-MFα-rChTRX-His的酿酒酵母转化子，取菌落制成菌液进行PCR扩增，筛选得INVSc1/pYES2/CT-MFα-rChTRX-His阳性克隆子。进一步的，所述步骤(3)中，通过培养、离心、收集上清液经过柱层析，得纯化后的上清蛋白液，具体步骤为：挑取阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-MFα-rChTRX-His)于30ml液体SC-U液体培养基，30℃震荡培养过夜，并测定OD600nm吸光值，取适量的培养液接种于100ml的SC-U诱导培养基中，震荡培养过夜，同时测定OD600nm使其为0.4；4℃、1500g离心5min，收集菌体，用1～2ml的SC-U诱导培养基悬浮菌体，重新接种100本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酿酒酵母表达重组鸡硫氧还蛋白，其特征在于，重组鸡硫氧还蛋白核苷酸序列为序列表1所示，重组鸡硫氧还蛋白氨基酸序列为序列表2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种酿酒酵母表达重组鸡硫氧还蛋白，其特征在于，重组鸡硫氧还蛋白核苷酸序列为序列表1所示，重组鸡硫氧还蛋白氨基酸序列为序列表2所示。


2.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达重组鸡硫氧还蛋白，其特征在于，所述重组鸡硫氧还蛋白核苷酸序列和重组鸡硫氧还蛋白氨基酸序列，是根据鸡硫氧还蛋白氨基酸序列以及酿酒酵母对密码子的偏爱性人工设计获得。


3.一种酿酒酵母表达重组鸡硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT-MFα-rChTRX-His的构建，具体包括：
鸡硫氧还蛋白基因的人工优化，以获得质粒pMD19-T-rChTRX-His；
对质粒pYES2/CT-MFα及以上胶回收的rChTRX-His片段进行双酶切，获得阳性克隆pYES2/CT-MFα-rChTRX-His；
(2)pYES2/CT-MFα-rChTRX-His工程菌的制备、转化，具体包括：
酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制；
将步骤(1)获得的pYES2/CT-MFα-rChTRX-His以及pYES2/CT-MFα质粒分别转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养基的培养及PCR扩增、筛选，获得阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-MFα-rChTRX-His)；
(3)含有pYES2/CT-MFα-rChTRX-His的酿酒酵母工程菌的摇瓶培养、诱导表达纯化及检定，具体包括：
将步骤(2)获得的阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-MFα-rChTRX-His)，通过培养、离心、收集上清液经过柱层析，得纯化后的上清蛋白液，经SDS-PAGE电泳以及鼠抗His单克隆抗体经Westernblot鉴定，均可观察到特异性条带，即为本发明获得的酿酒酵母表达重组鸡硫氧还蛋白。


4.根据权利要求3所述的一种酿酒酵母表达重组鸡硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，鸡硫氧还蛋白基因的人工优化，以获得质粒pMD19-T-rChTRX-His，具体步骤为：
根据鸡硫氧还蛋白氨基酸序列以及酿酒酵母对密码子的偏爱性，人工设计了酿酒酵母偏爱型鸡硫氧还蛋白基因，鸡硫氧还蛋白核苷酸序列为序列表1所示，鸡硫氧还蛋白氨基酸序列为序列表2所示；
将重组鸡硫氧还蛋白基因以ChTRX-His的顺序插入pMD19-TSimpleVector的HindⅢ酶切位点和XbaⅠ酶切位点之间，其5’端HindⅢ酶切位点，3’端接XbaⅠ酶切位点，由此得到质粒pMD19-T-rChTRX-His。


5.根据权利要求3所述的一种酿酒酵母表达重组鸡硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，对质粒pYES2/CT-MFα及以上胶回收的rChTRX-His片段进行双酶切，获得阳性克隆pYES2/CT-MFα-rChTRX-His，具体步骤为：
根据rChTRX-His基因的序列设计合成正向引物rChTRX-HisF和反向引物rChTRX-HisR，通过PCR扩增pMD19-T-rChTRX-His质粒中rChTRX-His基因，按照凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收；
用...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊，徐文俊，周炜，何志远，许高涛，吴蕾，吴博，
申请(专利权)人：芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34