一种乳铁蛋白制备方法技术

本发明专利技术涉及一种乳铁蛋白制备方法，其包括如下步骤：a)使原料乳液通过阳离子交换树脂层析柱；b)用洗脱液对步骤a)中的阳离子交换树脂进行包含至少两次洗脱的第一组洗脱，得到洗脱收集液；c)将步骤b)中的至少第2次洗脱收集液除盐；d)使步骤c)中经除盐的洗脱收集液通过阳离子交换树脂层析柱；e)用洗脱液对步骤d)中的阳离子交换树脂进行包含至少两次洗脱的第二组洗脱，得到洗脱收集液；f)将步骤e)中的至少最后一次洗脱收集液除盐并干燥得到乳铁蛋白产物。

【技术实现步骤摘要】
一种乳铁蛋白制备方法
本专利技术属于蛋白纯化制备
，具体地涉及一种乳铁蛋白制备方法，更具体地涉及一种以牛或羊脱脂乳、乳清液为原料制备乳铁蛋白的方法。
技术介绍
乳铁蛋白(Lf)是富含在初乳中的一种功能因子，它最初于1939年由Sorensen等在动物乳中发现，1953年Polis等在制备乳过氧化物酶时得到了它的粗制品，1960年Johansson和Montreuil等从人乳中首次分离出Lf。近代研究证明，Lf具有许多独特的生物学功能：增强铁的传递和吸收；广谱的抗菌性；免疫作用；抗氧化作用；促进肠道菌群的平衡；作为生长因子；抗炎症；抗病毒作用等。对Lf的分离、加工、综合利用的研究，已经成为食品界，特别是乳品界关心的热点。Grove最早使用DEAE纤维素阴离子交换树脂分离出较纯的Lf成分，此后，他又开发出磷酸纤维素交换色谱法，并由Foley等对此法加以改进，得到的Lf的纯度为81％左右；目前分离乳铁蛋白主要有色谱法(吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、固定化单系抗体法等)和超滤法。超滤法操作简便，费用相对较低，易于形成工业化规模，其缺点是乳铁蛋白纯度较低，色谱法的优点是分离效果好、纯度高，但分离成本高，应用离子交换色谱法分离乳铁蛋白实现了工业化生产，虽然成本得到控制，但成本仍然较高，离子树脂的寿命1年左右，偏短，采用轴向流进料方式，吸附率低(处理相同物流，需要更多的树脂)，树脂的安装填料损耗大等问题，造成离子交换色谱法提取成本仍然较高。CN104926936A公开了制备乳铁蛋白的方法，该方法利用阳离子交换树脂对液体乳进行离子交换处理，并通过盐溶液程序洗脱获得含有乳铁蛋白的盐溶液；采用超滤进行浓缩，进行干燥处理获得乳铁蛋白制品。CN106008704A公开了一种生产乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法，该方法以乳液为原料，利用大孔阳离子交换树脂柱进行离子交换处理，使用氯化钠或氯化钾水溶液对树脂柱进行程序洗脱，收集含有乳过氧化物酶的第一洗脱收集液和含有乳铁蛋白的第二洗脱收集液；将第一洗脱收集液、第二洗脱收集液分别经膜滤浓缩8～12倍，然后分别洗滤脱盐，得到乳过氧化物酶浓缩液和乳铁蛋白浓缩液。CN106008703B公开了一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，该方法同样使用阳离子交换树脂对牛乳中的乳铁蛋白进行吸附、解附；对解附液进行浓缩；得到浓缩液采用不溶性Fe3+螯合树脂对Fe3+进行吸附，再对浓缩液进行浓缩。获得低铁饱和度乳铁蛋。纯化乳铁蛋白的方法有许多种，许多公司选择阳离子交换色谱系统来大范围的获得乳铁蛋白。对于乳铁蛋白的分离纯化开始于上世纪80年代，许多公司都致力于开发获得高纯度乳铁蛋白工艺。对乳铁蛋白分离纯化的方法从最初的阳离子交换到亲和层析再到免疫学方法，以及各种方法的组合对于分离纯化乳铁蛋白都有个有利弊。目前使用离子交换色谱法制备乳铁蛋白研究较多，国外早已工业生产乳铁蛋白，2016年12月发布新的乳铁蛋白标准GB1903.17，将总蛋白质中乳铁蛋白含量由90％提高到95％，导致乳铁蛋白一度断货。很多申请的乳铁蛋白专利指标方法，按照GB1903.17-2016检测标准检测，蛋白质中乳铁蛋白含量很难达到95％。高纯度乳铁蛋白生产技术一直是当前行业技术难点，亟需解决问题之一。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术一个目的是提供一种操作简单、成本低、可工业化生产的高纯度乳铁蛋白制备方法。本专利技术的另一目的是提供一种能够以高的回收率获得高纯度乳铁蛋白的制备方法。专利技术人研究发现，当制备乳铁蛋白时，所得产物中乳铁蛋白在总蛋白质中含量达不到95％，这主要是因为混有部分过氧化物酶。当原料乳液通过阳离子树脂进行吸附时，阳离子树脂吸附牛乳中的蛋白质，主要是乳铁蛋白和过氧化物酶。乳铁蛋白吸附强度高于过氧化物酶。使用低浓度的钠或钾盐溶液洗脱时，可以首先将大部分过氧化物酶洗脱下来，但是仍然有一部分过氧化物酶残留未被洗脱。然后在使用高浓度的钠或钾盐溶液洗脱来获得乳铁蛋白洗脱收集液时，残留过氧化物酶的一部分也会被洗脱下来，从而获得的乳铁蛋白洗脱收集液中含有少量过氧化物酶，使得乳铁蛋白在总蛋白质中含量达不到95％。本专利技术人对乳铁蛋白洗脱和纯化工艺进行优化和改进，解决了上述技术问题，获得了一种操作简单、成本低，可工业化生产的高纯度乳铁蛋白制备方法，总蛋白质中乳铁蛋白含量达到95％以上，解决了现有乳铁蛋白制备方法中总蛋白质中乳铁蛋白含量达不到95％的技术难题。本专利技术方法制备的乳铁蛋白符合GB1903.17标准。并且，本专利技术的方法中乳铁蛋白回收率可以达到80％以上。总蛋白含量可以达到90％以上。本专利技术技术方案是：1.一种乳铁蛋白制备方法，其包括如下步骤：a)使原料乳液通过阳离子交换树脂层析柱；b)用洗脱液对步骤a)中的阳离子交换树脂进行包含至少两次洗脱的第一组洗脱，得到洗脱收集液；c)将步骤b)中的至少第2次洗脱收集液除盐；d)使步骤c)中经除盐的洗脱收集液通过阳离子交换树脂层析柱；e)用洗脱液对步骤d)中的阳离子交换树脂进行包含至少两次洗脱的第二组洗脱，得到洗脱收集液；f)将步骤e)中的至少最后一次洗脱收集液除盐并干燥得到乳铁蛋白产物。2.如条目1所述的方法，其中：在步骤b)中，第一组洗脱包含至少三次洗脱；在步骤f)中，将步骤e)中第二组洗脱中至少最后一次洗脱收集液与步骤b)中第一组洗脱中的至少最后一次洗脱收集液混合后，再进行除盐并干燥得到乳铁蛋白产物。3.如条目1-2之一所述的方法，其中步骤b)中使用浓度依次升高的洗脱液进行程序洗脱；且步骤e)中使用浓度依次升高的洗脱液进行程序洗脱。4.如条目1-3之一所述的方法，其中步骤a)中提供的原料乳液包含过氧化物酶。5.如条目1-4任一项所述的方法，其中：在步骤b)中，第一组洗脱包含三次洗脱；在步骤c)中，将步骤b)中的第2次洗脱收集液除盐；在步骤d)中，使步骤c)中经除盐的洗脱收集液通过阳离子交换树脂层析柱；在步骤e)中，用洗脱液对步骤d)中的阳离子交换树脂进行包含两次洗脱的第二组洗脱，得到洗脱收集液；在步骤f)中，将步骤e)中的第二洗脱收集液与步骤b)中的第三洗脱收集液组合，除盐并干燥得到乳铁蛋白产物。6.如条目1-5任一项所述的方法，其中步骤a)中的乳液为牛或羊脱脂乳、或乳清液。7.如条目1-6任一项所述的方法，其中步骤a)和步骤d)中的阳离子交换树脂各自独立地为琼脂糖型离子交换树脂、丙烯酸型离子交换树脂、聚苯乙烯型离子交换树脂中的任意一种或多种。8.如条目1-7任一项所述的方法，其中步骤b)中使用的洗脱液各自独立地为氯化钠或氯化钾溶液，优选地其钠或钾离子的浓度各自独立地为0.07-0.8mol/L、优选0.1-0.6mol/L、优选0.12-0.5mol/L；和/或步骤e)中使用的洗脱液各自独立地为氯化钠或氯化钾溶液，优选地其钠或钾离子的浓度各自独立地为0.07-0.8本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乳铁蛋白制备方法，其包括如下步骤：/na)使原料乳液通过阳离子交换树脂层析柱；/nb)用洗脱液对步骤a)中的阳离子交换树脂进行包含至少两次洗脱的第一组洗脱，得到洗脱收集液；/nc)将步骤b)中的至少第2次洗脱收集液除盐；/nd)使步骤c)中经除盐的洗脱收集液通过阳离子交换树脂层析柱；/ne)用洗脱液对步骤d)中的阳离子交换树脂进行包含至少两次洗脱的第二组洗脱，得到洗脱收集液；/nf)将步骤e)中的至少最后一次洗脱收集液除盐并干燥得到乳铁蛋白产物。/n

【技术特征摘要】
1.一种乳铁蛋白制备方法，其包括如下步骤：
a)使原料乳液通过阳离子交换树脂层析柱；
b)用洗脱液对步骤a)中的阳离子交换树脂进行包含至少两次洗脱的第一组洗脱，得到洗脱收集液；
c)将步骤b)中的至少第2次洗脱收集液除盐；
d)使步骤c)中经除盐的洗脱收集液通过阳离子交换树脂层析柱；
e)用洗脱液对步骤d)中的阳离子交换树脂进行包含至少两次洗脱的第二组洗脱，得到洗脱收集液；
f)将步骤e)中的至少最后一次洗脱收集液除盐并干燥得到乳铁蛋白产物。


2.如权利要求1所述的方法，其中：
在步骤b)中，第一组洗脱包含至少三次洗脱；
在步骤f)中，将步骤e)中第二组洗脱中至少最后一次洗脱收集液与步骤b)中第一组洗脱中的至少最后一次洗脱收集液混合后，再进行除盐并干燥得到乳铁蛋白产物。


3.如权利要求1-2之一所述的方法，其中步骤b)中使用浓度依次升高的洗脱液进行程序洗脱；且步骤e)中使用浓度依次升高的洗脱液进行程序洗脱。


4.如权利要求1-3之一所述的方法，其中步骤a)中提供的原料乳液包含过氧化物酶。


5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中：
在步骤b)中，第一组洗脱包含三次洗脱；
在步骤c)中，将步骤b)中的第2次洗脱收集液除盐；
在步骤d)中，使步骤c)中经除盐的洗脱收集液通过阳离子交换树脂层析柱；
在步骤e)中，用洗脱液对步骤d)中的阳离子交换树脂进行包含两次洗脱的第二组洗脱，得到洗脱收集液；
在步骤f)中，将步骤e)中的第二洗脱收集液与步骤b)中的第三洗脱收集液组合，除盐并干燥得到乳铁蛋白产物。


6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中步骤a)中的乳液为牛或羊脱脂乳、或乳清液。


7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其中步骤a)和步骤d)中的阳离子交换树脂各自独立地为琼脂糖型离子交换树脂、丙烯酸型离子交换树脂、聚苯乙烯型离子交换树脂中的任意一种或多种。


8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其中步骤b)中使用的洗脱液各自独立地为氯化钠或氯化钾溶液，优选地其钠或钾离子的浓度各自独立地为0.07-0.8mol/L、优选0.1-0.6mol/L、优选0.12-0.5mol/L；和/或步骤e)中使用的洗脱液各自独立地为...

【专利技术属性】
技术研发人员：解庆刚，刘洋，蒋士龙，石红丽，关海舟，孙建国，梁爱梅，冷友斌，
申请(专利权)人：黑龙江飞鹤乳业有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23