一种具有富集硝基化酪氨酸肽段功能的材料及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及硝基化酪氨酸肽段富集技术领域，尤其涉及一种具有富集硝基化酪氨酸肽段功能的材料及其筛选方法和应用。本发明专利技术的筛选方法能够通过筛选一种人工合成的硝基化酪氨酸肽段获得具有特异性结合氨基酸序列的材料来富集不同类型的更为复杂的硝基化酪氨酸肽段。本发明专利技术筛选方法选用的噬菌体随机肽库中的多肽分子量小，从而筛选得到的富集材料的分子量小，易于通过化学合成方法获得，相比抗体成本较低。同时该富集材料保存比较容易，富集的环境也可以比较剧烈，要求低。且通过该筛选方法筛选的富集材料肽对半复杂样品富集效果强。通过该筛选方法筛选的多肽能够从1000倍酶解BSA中富集硝基化酪氨酸肽段。

【技术实现步骤摘要】
一种具有富集硝基化酪氨酸肽段功能的材料及其制备方法和应用
本专利技术涉及富集硝基化酪氨酸肽段的
，尤其涉及一种具有富集硝基化酪氨酸肽段功能的材料及其制备方法和应用。
技术介绍
硝基化是一种硝基通过硝化反应连接到化合物上的一种氧化修饰，可以发生在脂肪酸，核酸和蛋白质中。蛋白质中的酪氨酸，色氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸都可以发生硝基化，通常蛋白质硝基化是指硝基化酪氨酸。蛋白质酪氨酸硝化修饰是指添加一个硝基（-NO2）到蛋白质酪氨酸的3号位上，生成3-硝基酪氨酸。正常生理组织中蛋白质会发生硝基化修饰以消耗内环境中的活性氧、获得新的功能、或者参与其他重要的生命活动。如豆类根瘤中的豆血红蛋白通过硝基化吸纳环境中的活性氮以减少机体氧化损伤。在硝基化氧化应激发生的病理部位，如神经退行性疾病病人的脑，肺癌病人的肺部，受损的植物组织，蛋白质硝基化程度会随着活性氧或活性氮浓度的增加而增加。pH值偏低的细胞微环境，如某些肿瘤组织，或代谢性酸中毒的情况下，也可能促进整体硝基化水平的提高。除此之外，蛋白质硝基化的发生还与衰老、伴随衰老发生的其他疾病，糖尿病、冠心病、哮喘等慢性病相关。生物样品体内硝基化酪氨酸的低丰度性，复杂样品的硝基化蛋白在鉴定前一般含有预分离或富集的步骤。蛋白质硝基化酪氨酸在许多领域被研究。如，样品质谱鉴定蛋白质；IP（多克隆抗体）+SDS-PAGE+胶内酶解分离样品质谱鉴定蛋白质；IP（多克隆抗体）+胶内酶解分离样品质谱鉴定蛋白质；其他分离方法，2DE分离，样品质谱鉴定蛋白质。常用的抗体缺乏对硝基酪氨酸的选择性，在某些组织中背景值较高，检测的选择性依赖于硝基化酪氨酸残基附近的特异性表位等等。目前的特异性吸附基本依赖于抗体，本文尝试用噬菌体展示的多肽富集硝基化肽段。1985年GeorgeP.Smith首次建立噬菌体展示技术，噬菌体展示随机肽库库容量很大，能够寻找到特异性肽结合硝基化酪氨酸，可以作为研究硝基化酪氨酸的一种工具。相对于具有其他硝基酪氨酸位置的肽，此方法对硝基酪氨酸的肽具有高的亲和力，这引起了对未来研究的需求。
技术实现思路
为解决抗体缺乏对硝基化的酪氨酸的选择性，或具有非特异性吸附，或结合的选择性依赖于硝基化酪氨酸残基附近的特异性表位的问题，本专利技术提出一种具有富集硝基化酪氨酸肽段功能的材料，该材料为噬菌体展示随机肽库中筛选得到的多肽，其是一种泛特异性的肽段，以进行无偏见的蛋白质组范围的硝基化酪氨酸肽段的富集，噬菌体展示随机肽库筛选的多肽，与传统的抗体技术相比，多肽来源更快，更便宜，技术要求低。此外，本专利技术还提出了利用上述材料的筛选方法和应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案予以实现：一种具有富集硝基化酪氨酸肽段功能的材料，包括如NT-1所示的多肽序列，即Thr-Leu-Trp-Pro-Phe-Asp-Leu-Trp-Leu-Lys-Thr-Arg。本专利技术的具有富集硝基化酪氨酸肽段功能的材料的筛选方法，包括如下步骤：S1：噬菌体展示随机肽库先与对照组珠子（偶联了未硝基化酪氨酸的肽段的CNBr活化琼脂糖珠）预孵育，然后离心将上清与偶联了硝基化酪氨酸的肽段的CNBr活化琼脂糖珠混合进行孵育，富集与硝基化酪氨酸特异性结合的噬菌体并进行扩增；S2：挑取扩增得到的噬菌体中的阳性克隆后进行DNA测序，获得多肽的氨基酸序列后合成得到多肽肽段；S3：通过富集实验验证筛选得到的能够富集硝基化酪氨酸肽段的材料；所述噬菌体展示随机肽库中的多肽的氨基酸数量少于20个。作为优选地，所述噬菌体展示随机肽库中的多肽的氨基酸数量为12个。本专利技术提供的具有富集硝基化酪氨酸肽段功能的材料的筛选方法可以针对不同的硝基化酪氨酸肽段快速筛选出能够结合的肽段。该筛选方法中选用的噬菌体随机肽库中的多肽分子量小，从而筛选得到的富集材料的分子量小，易于通过化学合成方法获得，降低了富集硝基化酪氨酸肽段的成本。优选地，材料与硝基化酪氨酸特异性结合的筛选结合靶点是单独的硝基化酪氨酸，或者是肽段的硝基化酪氨酸，或者是蛋白质的硝基化酪氨酸，具体为GGGGY(NO2)GGG。所述步骤S1中，噬菌体展示随机肽库与偶联了硝基化酪氨酸的肽段的CNBr珠子混合的温度优选在37℃下，50rpm旋转孵育；所述步骤S1中，与偶联了硝基化酪氨酸的肽段的CNBr活化琼脂糖珠混合后，还包括：离心去除未结合的噬菌体，然后采用洗脱液从硝基化肽段上洗脱下噬菌体；所述洗脱液为酸性缓冲液，具体地，所述酸性缓冲液为Gly-HCl。所述步骤S1中，扩增操作具体步骤为：将富集得到的噬菌体感染大肠杆菌后进行培养；所述培养的条件，优选为37℃、250rpm振荡培养4.5h。本专利技术步骤S2中，还包括：对扩增得到的噬菌体重复步骤S11～5次，优选为4次。本专利技术步骤S2中，挑取扩增得到的噬菌体中的阳性克隆具体为：将步骤S1中噬菌体扩增后的大肠杆菌接种至平板培养基上进行培养，挑取蓝色噬菌斑，得到阳性克隆。将所述阳性克隆进行DNA测序，从而获得多肽的氨基酸序列，利用化学合成法合成多肽，合成的多肽为D型多肽和L型多肽，本专利技术实施例筛选的多肽为L型多肽。本专利技术步骤S3中，富集实验验证为使用不同质量比的酶解BSA肽段与GGGGY(NO2)GGG肽段混合的实验验证。GGGGY(NO2)GGG肽段与酶解BSA肽段质量比为1:0、1:250、1:1000。实验证明本专利技术筛选得到的富集硝基化酪氨酸的多肽序列对GGGGY(NO2)GGG肽段有明显的富集作用。本专利技术步骤S3中，富集实验验证还包括用SVSSSSY(NO2)R、LLLGGGSY(NO2)K、EGVLY(NO2)VGSK、LFEMAY(NO2)KK、QIDNPDY(NO2)KG、AGNTIHAILLY(NO2)R、DFMNEEY(NO2)SQEVR、EDQTEY(NO2)LEER中的一种或多种的硝基化酪氨酸多肽与酶解BSA肽段按不同质量比混合的实验验证。上述硝基化酪氨酸肽段与酶解BSA肽段质量比为1:0、1:250、1:1000。结果显示，所述硝基化酪氨酸肽段与酶解BSA肽段质量比为1:0、1:250时，硝基化酪氨酸8条肽段可以全部富集。所述硝基化酪氨酸肽段与酶解BSA肽段质量比为1:1000时，只能富集到7条硝基化酪氨酸肽段，SVSSSSY(NO2)R，LLLGGGSY(NO2)K，EGVLY(NO2)VGSK，LFEMAY(NO2)KK，QIDNPDY(NO2)KG，AGNTIHAILLY(NO2)R，EDQTEY(NO2)LEER。实验证明，本专利技术筛选得到的富集硝基化酪氨酸的多肽序列对不同类型的硝基化肽段有明显的富集作用。本专利技术还提供了上述具有富集硝基化酪氨酸肽段功能的材料在半复杂样品中富集硝基化酪氨酸肽段的应用。从以上技术方案可以看出，本专利技术具有以下优点：本专利技术的筛选方法能够通过筛选一种人工合成的硝基化酪氨酸肽段获得具有特异性结合氨基酸序列的材料来富集不同类型的更为复杂的硝本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有富集硝基化酪氨酸肽段功能的材料，其特征在于，包括如NT-1所示的多肽序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有富集硝基化酪氨酸肽段功能的材料，其特征在于，包括如NT-1所示的多肽序列。


2.根据权利要求1所述的材料的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：噬菌体展示随机肽库先与对照组珠子预孵育，然后离心将上清与偶联了硝基化酪氨酸的肽段的CNBr活化琼脂糖珠混合进行孵育，富集与硝基化酪氨酸特异性结合的噬菌体并进行扩增；
S2：挑取扩增得到的噬菌体中的阳性克隆后进行DNA测序，获得多肽的氨基酸序列后合成得到多肽肽段；
S3：通过富集实验验证筛选得到的能够富集硝基化酪氨酸肽段的材料；
其中，所述噬菌体展示随机肽库中的多肽的氨基酸数量少于20个。


3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述噬菌体展示随机肽库中的多肽的氨基酸数量为12个。


4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤S1中，噬菌体与硝基化酪氨酸特异性结合的筛选靶点为GGGGY(NO2)GGG。


5.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤S1中，噬菌体展示随机肽库与偶联了硝基化酪氨酸的肽段的CNBr活化琼脂糖珠混合的孵育条件为温度为37℃，50rpm旋转孵育。


6.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤S1中，扩增操作具体步骤为：将富集得到的噬菌体感染大肠杆菌后进行培养；所述培养的条件为37℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘中华，程易，王迎，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43