一种亲和切向流过滤系统及其构建方法和外泌体提取方法及应用技术方案

本发明专利技术公开了一种亲和切向流过滤系统及其构建方法和外泌体提取方法及应用。所述提取方法包括：将所述含外泌体的样本溶液与亲和液充分混合置于第一储存罐中，打开开关K2，断开开关K1、K3，开启第一蠕动泵，流经Reprotide

【技术实现步骤摘要】
一种亲和切向流过滤系统及其构建方法和外泌体提取方法及应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种亲和切向流过滤系统及其构建方法和外泌体提取方法及应用。
技术介绍
外泌体是有活细胞分泌的磷脂双分子层结构的小囊泡，直径在30-150nm，可存在于各种体液中，如血清、血浆、唾液、尿液，腹水、脊髓液、乳汁等。外泌体中含有多种生物分子，如mRNA、miRNA、蛋白质、脂质等，可以传递给受体细胞，从而改变受体细胞的生理功能或病理功能。近几年，外泌体作为细胞间的信息传递工具及各种疾病的生物标志物而引起广泛的关注，外泌体具有在生物医药及疾病诊断领域的应用开发潜力。针对外泌体的提取纯化没有一个统一的标准，常用的方法有很多种，超速离心法、密度梯度离心法，超滤法，聚合物沉淀法，免疫捕获法等。超速离心法虽然是公认的外泌体提取的“金标准”方法，但是操作费时费力、高度依赖人工，回收率低，外泌体形态大小不一，高速离心会损害外泌体而影响下游实验。密度梯度离心法虽然可以获得很纯的外泌体，但该方法操作繁琐，重复性差，耗时很长，回收率低，不适合大批量提取外泌体。超滤法可以方便快速的提取外泌体，但该方法提取的外泌体中含有大颗粒杂质污染，严重影响下游应用。聚合物沉淀法提取的外泌体中杂蛋白污染多，颗粒形态不均一，影响下游分析。免疫捕获法虽然可以特异性地捕获外泌体，获得的外泌体纯度高，但该方法成本高且产量低，不能提取样本中所有的外泌体，只能提取某种表面抗原阳性的外泌体。但是，血清，血浆，牛奶等成分复杂的样本，由于溶液中含有大量的颗粒物质，如载脂蛋白，脂颗粒等，可对外泌体造成严重污染，而目前的众多方法中，还没有针对此类样品的外泌体批量提取方法。综上所述，急需一种操作方便，提取效率高，获得的外泌体纯度高，可以适合大体积复杂样本的外泌体提取纯化方法。
技术实现思路
为此，本专利技术提供一种亲和切向流过滤系统及其构建方法和外泌体提取方法及应用，以解决现有技术中操作复杂、提取效率低、样本量小、提取的外泌体纯度低、重复性差等问题。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：根据本专利技术的第一方面提供的一种用于外泌体提取的亲和切向流过滤系统，所述过滤系统包括：第一储存罐、第二储存罐、ReprotideTM511蛋白交联纳米亲和微球柱、过滤装置、第一蠕动泵、第二蠕动泵和三个开关K1、K2、K3；其中，第一储存罐的出口经第一蠕动泵与ReprotideTM511蛋白交联纳米亲和微球柱的入口连接，ReprotideTM511蛋白交联纳米亲和微球柱的出口分别通过开关K1、K2、K3的开闭来控制柱内的液体流向，其中开关K1、K2关闭时，开开关K3，液体流出体系，开关K1、K3关闭时，开开关K2，液体循环流回第一储存罐，开关K2、K3关闭时，开开关K1，液体经第二储存罐的入口进入第二储存罐；第二储存罐的出口经第二蠕动泵与过滤装置的入口连接，过滤装置的出口与第二储存罐的第二入口连接，经过滤装置过滤后的液体直接流出体系；其中，所述过滤装置是设有切向流过滤膜F的过滤体系，所述切向流过滤膜F的截留分子量为50-750kD。根据本专利技术的第二方面提供的一种应用亲和切向流过滤系统提取外泌体的方法，所述方法包括以下步骤：步骤一，将样本溶液进行预处理，得含外泌体的样本溶液；步骤二，将所述含外泌体的样本溶液与亲和液充分混合，并置于第一储存罐中，打开开关K2，断开开关K1、K3，开启第一蠕动泵，让溶液流经ReprotideTM511蛋白交联纳米亲和微球柱，并循环流动2-5h；步骤三，断开开关K1、K2，打开开关K3，将第一存储罐的液体排出后，再向第一存储罐中加入洗涤液，冲洗后洗涤液排出；步骤四，打开开关K2，关闭开关K3、K1，向第一储存罐中加入洗脱液进行洗脱，循环洗脱反应20-60min；步骤五，打开开关K1，关闭开关K3、K2，将溶液泵入第二储存罐中，打开第二蠕动泵，让溶液经过滤装置，循环浓缩过滤至最小运行体积；加入无菌PBS缓冲液，循环浓缩过滤，即得提取纯化的外泌体溶液；其中，所述过滤体系设有切向流过滤膜F的过滤体系，所述切向流过滤膜F的截留分子量为50-750kD。进一步的，所述样本预处理的方法是将样本加入离心管中，5000-12000g，离心5-50min，取上清液，过0.22-0.45μm滤膜过滤除菌。进一步的，所述样本溶液包括植物和动物来源的体液，包括血清、血浆、尿液、牛奶或富血小板的血浆；也包括不同来源的细胞，包括植物细胞，动物体细胞及其干细胞的培养上清液。进一步的，所述ReprotideTM511蛋白交联纳米亲和微球柱为蛋白交联纳米亲和微球为蛋白与纳米微球偶联物的结合体；其中，所述蛋白为生物素标记的ReprotideTM511蛋白；所述纳米微球偶联物为链霉亲和素偶联的直径为200-2000nm的纳米羧基硅胶微球；将制备的ReprotideTM511蛋白交联纳米亲和微球装入色谱柱，并盖上顶盖，制得ReprotideTM511蛋白交联纳米亲和微球柱。进一步的，所述ReprotideTM511蛋白交联纳米亲和微球的制备方法包括以下步骤：将ReprotideTM511蛋白加入活性生物素，4℃孵育1-24h，再用脱盐柱去除游离的生物素，用PBS缓冲液洗脱，得到生物素标记的ReprotideTM511蛋白；再将生物素标记的ReprotideTM511蛋白加入链霉亲和素偶联的纳米羧基硅胶微球中，反应0.5-3h后，离心得沉淀，所述沉淀即为ReprotideTM511蛋白交联纳米亲和微球。进一步的，所述链霉亲和素偶联的纳米羧基硅胶微球的制备方法为：将DMF(N,N-二甲基甲酰胺)加入MES缓冲液洗涤纳米羧基硅胶微球中，充分混匀得到混合液；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入N-羟基琥珀酰亚胺加入所述混合液中，混匀，离心弃上清，得第一沉淀物；将所述链霉亲和素溶液加入第一沉淀物中，室温混合，离心，得第二沉淀物；将封闭液加入到所述第二沉淀物中，混合反应，离心，得到链霉亲和素偶联纳米羧基硅胶微球。进一步的，所述亲和液包括HEPES、CaCl2、NaCl和MgCl2；所述洗涤液包括Tris-HCl、NaCl、CaCl2和MgCl2；所述洗脱液包括Tris-HCl、NaCl和EDTA。进一步的，所述过滤装置的最小运行体积为50-500mL。根据本专利技术的第三方面提供的上述方法制备的外泌体，可在医美类产品、促进伤口愈合的外泌体液体敷料、缓解哮喘及急性呼吸窘迫症的外泌体喷雾的制备以及外泌体相关的生物制品制备中的应用。本专利技术具有如下优点：本专利技术提供了用于大体积复杂样本外泌体提取制备纯化的亲和切向流过滤系统及制备方法与应用，该方法可对各种样本来源的外泌体提取纯化，特别适合提取大体积复杂样本的外泌体。亲和切向流过滤系统操作方便，提取效率高，获得的外泌体纯度高，产量多，还能保证其生物学活性及完整性，该系统可实现复杂样本外泌体的批量自动化提取，具有极大本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于外泌体提取的亲和切向流过滤系统，其特征在于，所述过滤系统包括：第一储存罐、第二储存罐、Reprotide

【技术特征摘要】
1.一种用于外泌体提取的亲和切向流过滤系统，其特征在于，所述过滤系统包括：第一储存罐、第二储存罐、ReprotideTM511蛋白交联纳米亲和微球柱、过滤装置、第一蠕动泵、第二蠕动泵和三个开关K1、K2、K3；
其中，第一储存罐的出口经第一蠕动泵与ReprotideTM511蛋白交联纳米亲和微球柱的入口连接，ReprotideTM511蛋白交联纳米亲和微球柱的出口分别通过开关K1、K2、K3的开闭来控制柱内的液体流向，其中开关K1、K2关闭时，开开关K3，液体流出体系，开关K1、K3关闭时，开开关K2，液体循环流回第一储存罐，开关K2、K3关闭时，开开关K1，液体经第二储存罐的入口进入第二储存罐；第二储存罐的出口经第二蠕动泵与过滤装置的入口连接，过滤装置的出口与第二储存罐的第二入口连接，经过滤装置过滤后的液体直接流出体系；
其中，所述过滤装置是设有切向流过滤膜F的过滤体系，所述切向流过滤膜F的截留分子量为50-750kD。


2.一种应用亲和切向流过滤系统提取外泌体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤一，将样本溶液进行预处理，得含外泌体的样本溶液；
步骤二，将所述含外泌体的样本溶液与亲和液充分混合，并置于第一储存罐中，打开开关K2，断开开关K1、K3，开启第一蠕动泵，让溶液流经ReprotideTM511蛋白交联纳米亲和微球柱，并循环流动2-5h；
步骤三，断开开关K1、K2，打开开关K3，将第一存储罐的液体排出后，再向第一存储罐中加入洗涤液，冲洗后洗涤液排出；
步骤四，打开开关K2，关闭开关K3、K1，向第一储存罐中加入洗脱液进行洗脱，循环洗脱反应20-60min；
步骤五，打开开关K1，关闭开关K3、K2，将溶液泵入第二储存罐中，打开第二蠕动泵，让溶液经过滤装置，循环浓缩过滤至最小运行体积；加入无菌PBS缓冲液，循环浓缩过滤，即得提取纯化的外泌体溶液；
其中，所述过滤体系设有切向流过滤膜F的过滤体系，所述切向流过滤膜F的截留分子量为50-750kD。


3.根据权利要求2所述一种应用亲和切向流过滤系统提取外泌体的方法，其特征在于，所述样本预处理的方法是将样本加入离心管中，5000-12000g，离心5-50min，取上清液，过0.22-0.45μm滤膜过滤除菌。


4.根据权利要求2所述一种应用亲和切向流过滤系统提取外泌体的方法，其特征在于，所述样本溶液包括植物和动物来源的体液，包括血清、血浆、尿液、牛奶或富血小板的血浆；也包括不同来源的细胞，包...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海心，
申请(专利权)人：瑞太生物科技沈阳有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21