一种用于超灵敏识别HIVp24抗原的免疫荧光和二维可视化多模式分析方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种用于超灵敏识别HIV p24抗原的免疫荧光和二维可视化多模式分析方法及其应用，涉及生物医学诊断分析方法技术领域，该分析方法包括HIV p24抗原与修饰了生物素的抗体发生抗原

【技术实现步骤摘要】
一种用于超灵敏识别HIV p24抗原的免疫荧光和二维可视化多模式分析方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医学诊断分析方法
，尤其是涉及一种用于超灵敏识别HIV p24抗原的免疫荧光和二维可视化多模式分析方法及其应用。

技术介绍

[0002]艾滋病(AIDS)是由HIV引起的严重威胁人类健康重大传染病，其死亡数和死亡率居我国法定传染病的首位。据世界卫生组织报告，到2018年，艾滋病毒携带者(PLWH)已超过3790万，其中只有75％的人知道自己的感染状况。HIV感染可分为三个阶段：急性HIV感染(AHI)，无症状感染和AIDS。其中，AHI是最危险的感染阶段，感染风险为无症状感染期的26倍。联合国艾滋病规划署/世界卫生组织提出的90
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90
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90目标和世界艾滋病日的“Know your status”主题均强调，筛查HIV感染对于艾滋病的预防和控制具有深远的意义，尤其是筛查AHI。早期筛查可以及早诊断和有效治疗，从而可以提高总生存率并减少传播。
[0003]现在第四代抗原抗体试剂已有商品化试剂盒，并且广泛用于临床检测中，可以同时鉴定HIV
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1 p24抗原和抗HIV IgM和IgG抗体，从而将“窗口期”缩短到大约2周。然而，该试剂不能区分抗原和抗体，导致不清楚疾病阶段。HIV
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1 p24抗原比抗体早出现约7天，是检测中最早出现的蛋白质生物标记之一。因此，HIV
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1 p24抗原检测在疾病的早期检测中具有重要的价值。
[0004]现有HIV p24检测方法主要是利用免疫分析原理，通过在检测抗体上标记电化学活性物质三吡啶钌，或者辣根过氧化物酶(HRP，催化底物TMB显色)，其分别通过监测电化学发光信号和紫外吸收信号实现对p24的检测。然而，以上电化学发光方法仪器成本高，紫外吸光光谱仪分析灵敏度低，且易受检测介质的干扰；最为重要的是其均需要依靠现有检测仪器，难以实现便携式可视化快速分析。
[0005]即使现已有一些可视化颜色读取的HIV p24分析方法被报道，但其仅仅是颜色这一维度上的识别。对于一些色盲甚至是色弱人员，其方法的准确性和有效性将会受到很大影响。因此，发展多维度可视化分析方法具有重要意义的。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种用于超灵敏识别HIV p24抗原的免疫荧光和二维可视化多模式分析方法，以解决现有临床HIV p24分析方法具有以下不足：1.免疫识别
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电化学发光/化学发光/紫外吸收光谱，其检测灵敏度低，仅仅可实现pg/mL级别的检测限；2.对仪器依赖性大，难以实现POCT分析；3.电化学发光和化学发光等仪器昂贵，难以实现小型化便携式，限制其在基层医院推广。
[0007]本专利技术的目的之二在于提供一种上述用于超灵敏识别HIV p24抗原的免疫荧光和二维可视化多模式分析方法的应用。
[0008]为了实现上述目的之一，本专利技术提供了一种用于超灵敏识别HIV p24抗原的免疫
荧光和二维可视化多模式分析方法，所述方法包括HIV p24抗原与修饰了生物素的抗体发生抗原
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抗体免疫识别反应，引入聚T链，或者引入核酸链与聚合酶辅助延伸反应生成聚T链，聚T链与Cu
2+
形成聚T模版Cu NPs，结合QDs选择性识别Cu
2+
和聚T模版Cu NPs的现象，基于聚T模版Cu NPs或者QDs的荧光信号识别单一目标物，所述目标物为HIVp24抗原。
[0009]根据一种优选实施方式，以QDs为信号分子时，构建基于颜色和试纸条距离的二维变化分析模式，以聚T模版Cu NPs为信号信号分子时，构建基于荧光信号变化分析模式。
[0010]根据一种优选实施方式，所述水解酶为TdT酶、phi29聚合酶或者延伸酶。
[0011]根据一种优选实施方式，所述核酸链为DNA模版、不同序列的ssDNA和和双链DNA。
[0012]根据一种优选实施方式，所述Cu
2+
可替换为Ag
+
。
[0013]根据一种优选实施方式，所述QDs包括CdTe QDs或者CdSe QDs。
[0014]根据一种优选实施方式，所述聚T模版CuNPs的激发波长为340nm。
[0015]根据一种优选实施方式，所述免疫荧光和二维可视化多模式分析方法是利用所述QDs的强发光特性，整合喷墨打印技术，实现颜色和距离读取的二维HIV p24抗原分析方法。
[0016]为了实现上述目的之二，本专利技术提供了一种用于超灵敏识别HIV p24抗原的免疫荧光和二维可视化多模式分析方法的应用，所述应用包括将上述任一所述的用于超灵敏识别HIV p24抗原的免疫荧光和二维可视化多模式分析方法应用于临床HIV患者血清中p24抗原分析。
[0017]本专利技术提供的一种用于超灵敏识别HIV p24抗原的免疫荧光和二维可视化多模式分析方法及其应用，具有以下技术效果：
[0018](1)本专利技术在保留抗原
‑
抗体免疫识别反应的前提下，引入核酸聚T链模版铜纳米粒子(CuNPs)，将其作为信号分子和识别介质，构建了多模式二维可视化荧光分析方法，无核酸信号放大技术引入时，其可实现与现有临床方法相近的灵敏度。
[0019](2)同时整合前期发现的基于QDs的选择性阳离子交换反应，实现了颜色和距离读取的POCT分析。
[0020](3)此外，该方法使用荧光分析技术，现已有多种便携式小型化荧光仪供使用，故该专利技术不仅仅为临床免疫分析提供了一种新的方法，同时为今后疾病的POCT分析奠定了基础。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]图1是基于QDs选择性识别反应和TdT酶辅助的HIV p24的免疫二维可视化和荧光分析原理图；
[0023]图2是聚T模版CuNPs和QDs的表征，以及p24分析可行性验证；
[0024]图3是T40模版CuNPs作为信号分子时HIV p24分析条件优化；
[0025]图4是选择性阳离子交换辅助的HIV p24分析条件优化；
[0026]图5是TdT酶辅助HIV p24分析条件优化；
[0027]图6是不同分析模式下HIV p24分析性能；
[0028]图7是临床HIV患者血清样品分析结果。
具体实施方式
[0029]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于超灵敏识别HIV p24抗原的免疫荧光和二维可视化多模式分析方法，其特征在于，所述方法包括HIV p24抗原与修饰了生物素的抗体发生抗原
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抗体免疫识别反应，引入聚T链，或者引入核酸链与聚合酶辅助延伸反应生成聚T链，聚T链与Cu
2+
形成聚T模版Cu NPs，结合QDs选择性识别Cu
2+
和聚T模版Cu NPs的现象，基于聚T模版Cu NPs或者QDs的荧光信号识别单一目标物，所述目标物为HIV p24抗原。2.根据权利要求1所述的用于超灵敏识别HIV p24抗原的免疫荧光和二维可视化多模式分析方法，其特征在于，以QDs为信号分子时，构建基于颜色和试纸条距离的二维变化分析模式，以聚T模版Cu NPs为信号信号分子时，构建基于荧光信号变化分析模式。3.根据权利要求2所述的用于超灵敏识别HIV p24抗原的免疫荧光和二维可视化多模式分析方法，其特征在于，所述聚合酶为TdT酶、phi29聚合酶或者延伸酶。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的用于超灵敏识别HIV p24抗原的免疫荧光和二维可视化多模式分析方法，其特征在于，所述核酸链为DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈飘飘，唐卓芸，应斌武，陶传敏，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：