一种多肽中测定N,N-二异丙基碳二亚胺含量的气相分析方法技术

本发明专利技术涉及分析化学领域，具体涉及一种多肽中测定N,N二异丙基碳二亚胺含量的气相分析方法。本发明专利技术的分析方法具有灵敏度高、稳定性好等特点。该方法包括以下步骤：1)取待测多肽样品，加入碱性溶剂使其溶解后，用有机溶剂制备待测样品；2)取待测多肽样品，加入碱性溶剂使其溶解后，再加入用有机溶剂和混合溶剂溶解后的N,N二异丙基碳二亚胺对照品贮备液，以制备待测对照品溶液；3)采用气相色谱法对上述溶液进行检测，4)按标准加入法计算被测样品中N,N二异丙基碳二亚胺的含量。N二异丙基碳二亚胺的含量。N二异丙基碳二亚胺的含量。

【技术实现步骤摘要】
一种多肽中测定N,N
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二异丙基碳二亚胺含量的气相分析方法


[0001]本专利技术涉及分析化学领域，具体涉及一种多肽中测定N,N
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二异丙基碳二亚胺含量的气相分析方法。

技术介绍

[0002]胸腺法新是适用于治疗慢性乙型肝炎，可作为免疫损害病者的疫苗免疫应答增强剂，为化学合成的由二十八个氨基酸组成的多肽，为N
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乙酰基
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L
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丝氨酰
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L
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α
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天冬氨酰
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L
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丙氨酰
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L
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丙氨酰
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L
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缬氨酰
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L
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α天冬氨酰
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L
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苏氨酰
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L
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丝氨酰
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L
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丝氨酰
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L
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α谷氨酰
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L
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异亮氨酰
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L
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苏氨酰
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L
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苏氨酰
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L
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赖氨酰
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L
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α
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天冬氨酰
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L
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亮氨酰
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L
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赖氨酰
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>L
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α
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谷氨酰
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L
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赖氨酰
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L
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赖氨酰
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L
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α
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谷氨酰
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L
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缬氨酰
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L
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缬氨酰
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L
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α
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谷氨酰
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L
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α
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谷氨酰
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L
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丙氨酿
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L
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α
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谷氨酰
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L
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天冬酰胺，注射用胸腺法新通过刺激外周血液淋巴细胞丝裂原来促进T淋巴细胞的成熟，增加抗原或丝裂原激活后T细胞分泌的干扰素、干扰素以及白介素2、白介素3等淋巴因子水平，同时增加T细胞表面淋巴因子受体水平，还可通过对CD4细胞的激活，增强异体和自体的人类混合淋巴细胞反应。
[0003]多肽在合成过程中经常使用到N,N
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二异丙基碳二亚胺作为缩合剂。如胸腺法新合成中就使用到了N,N
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二异丙基碳二亚胺。此外在生长抑素、加压素等多肽的合成中同样使用了N,N
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二异丙基碳二亚胺。上述药品中使用了N,N
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二异丙基碳二亚胺的，均有残留的可能，且N,N
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二异丙基碳二亚胺在欧洲药典给出的基因毒性杂质之警示结构一文中明确指出了N,N
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二异丙基碳二亚胺具有基因毒性杂质警示结构，是一个潜在的基因毒性杂质，在药品中是要严格控制其残留量。所以建立一种检测N,N
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二异丙基碳二亚胺的方法，完善多肽的质量控制，对于提升胸腺法新等多肽质量，减少患者用药风险，是非常有必要的。
[0004]目前各国药典均未收载N,N
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二异丙基碳二亚胺的有效测定方法，相关文献记载了N,N
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二异丙基碳二亚胺的检测方法，如深圳翰宇药业股份有限公司、一种测定N,N
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二异丙基碳二亚胺的方法(专利号CN201510148254.2)，马庆华等人、多糖蛋白结合疫苗中残余碳二亚胺(EDAC)的检测方法的建立(第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会)，但是上述方法采用了液质联用的方式进行测定，该方法需要购买价格高昂的质谱，对于大多数企业而言，操作繁琐、实用性不强。
[0005]因此，建立一套操作简单，定量准确并且实用的定量分析方法、以测定多肽产品中N,N
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二异丙基碳二亚胺的含量，特别是胸腺法新产品中N,N
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二异丙基碳二亚胺的含量是非常有必要的，这有助于提高用药的安全性。

技术实现思路

[0006]针对以上技术情况，本专利技术提供一种测定N,N
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二异丙基碳二亚胺含量的气相分析方法，特别是胸腺法新中N,N
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二异丙基碳二亚胺含量的气相分析方法。本专利技术方法包括以下步骤：
[0007]一种多肽中测定N,N
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二异丙基碳二亚胺含量的气相分析方法，包括以下步骤：
[0008]1)取N,N
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二异丙基碳二酰亚胺适量，用有机溶剂和混合溶剂稀释至一定浓度，作为对照品贮备液；取待测多肽样品，加入碱性溶剂使其溶解后，再加入适量对照品贮备液，混匀并用混合溶剂稀释至一定浓度，作为对照品溶液；
[0009]2)取待测多肽样品适量，加入碱性溶剂使其溶解后，再用混合溶剂进行稀释，作为供试品溶液；
[0010]3)采用气相色谱法对上述溶液进行检测，其中气相色谱条件为：
[0011]色谱柱：以100％二甲基聚硅氧烷为固定相的色谱柱或性质相同、相似的其他色谱柱；色谱柱升温程序：起始柱温为30℃～60℃；保持时间为0分钟～20分钟；升温速率为2℃～20℃/min，升至60℃～100℃，保持0分钟～10分钟；再以升温速率为2℃～20℃/min，升至80℃～100℃，保持0分钟～10分钟；再以升温速率为2℃～20℃/min，升至100℃～240℃，保持0分钟～15分钟；再以升温速率为2℃～20℃/min，升至240℃～260℃，保持10分钟～25分钟；4)按标准加入法计算被测样品中N,N
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二异丙基碳二亚胺的含量。
[0012]优选的，色谱柱升温程序：起始柱温为40℃；保持时间为2分钟；以5℃/min的升温速率升至80℃，维持3分钟；再以5℃/min的升温速率升至120℃，维持3分钟；再以10℃/min的升温速率升至180℃，维持7分钟；再以10℃/min的升温速率升至240℃，维持17分钟；N,N
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二异丙基碳二亚胺其中，所述步骤1)和2)中的多肽样品为胸腺法新。
[0014]作为本专利技术实施方案之一，所述步骤1)和2)中的碱性溶剂选自水配制的氢氧化钠溶液，作为进一步实施方案之一，本专利技术所述碱性溶剂的浓度为0.5％～1.0％(w/w)；作为更进一步实施方案之一、本专利技术所述碱性溶剂的浓度为1.0％的氢氧化钠溶液(w/w)；
[0015]作为本专利技术实施方案之一，所述步骤1)和2)中的多肽样品溶解后的pH值应不低于8，是为了保证多肽样品溶液呈现碱性环境，避免待测成分N,N
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多肽中测定N,N
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二异丙基碳二亚胺含量的气相分析方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取N,N
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二异丙基碳二酰亚胺适量，用有机溶剂和混合溶剂稀释至一定浓度，作为对照品贮备液；取待测多肽样品，加入碱性溶剂使其溶解后，再加入适量对照品贮备液，混匀并用混合溶剂稀释至一定浓度，作为对照品溶液；2)取待测多肽样品适量，加入碱性溶剂使其溶解后，再用混合溶剂进行稀释，作为供试品溶液；3)采用气相色谱法对上述溶液进行检测，其中气相色谱条件为：色谱柱：以100％二甲基聚硅氧烷为固定相的色谱柱或性质相同、相似的其他色谱柱；色谱柱升温程序：起始柱温为30℃～60℃；保持时间为0分钟～20分钟；升温速率为2℃～20℃/min，升至60℃～100℃，保持0分钟～10分钟；再以升温速率为2℃～20℃/min，升至80℃～100℃，保持0分钟～10分钟；再以升温速率为2℃～20℃/min，升至100℃～240℃，保持0分钟～15分钟；再以升温速率为2℃～20℃/min，升至240℃～260℃，保持10分钟～25分钟；4)按标准加入法计算被测样品中N,N
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二异丙基碳二亚胺的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)和2)中的多肽样品为胸腺法新；所述步骤1)和2)中的碱性溶剂选自水配制的氢氧化钠溶液，优选的碱性溶剂的浓度为0.5％～1.0％(w/w)；所述步骤1)和2)中的多肽样品溶解后的pH值应不低于8；所述步骤1)和2)中的有机溶剂选自甲醇、乙醇或它们任意混合的溶液，所述步骤2)中的混合溶剂选自水与甲醇、水与乙醇或水与甲醇和乙醇它们任意混合的溶液；所述步骤1)和2)中使用的水为纯化水和超纯水。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)和2)中的碱性溶剂的浓度为1.0％的氢氧化钠溶液(w/w)，所述步骤2)中的混合溶剂为90％甲醇水溶液。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的色谱柱为以100％二甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管柱的色谱柱，优选的色谱柱为：30m～60m长度；0.1μm～5μm膜厚、0.25mm～0.53mm内径，进一步优选的色谱柱为30m
×
0.53mm
×
5μm的色谱柱。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的气相色谱条件还包括：柱流量为1ml/min～10ml/min，优选的柱流量为1ml/min；所述步骤3)中所述载气为高纯度氮气或氦气；所述步骤3)中的气相色谱条件还包括：分流进样或不分流进样，其中，分流进样的分流比为1∶1～15∶1，优选的，分流进样的分流比...

【专利技术属性】
技术研发人员：王平，凌振宏，柴洪帆，吴春暖，朱云贵，
申请(专利权)人：海南中和药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：